[发明专利]一种阿魏酸酯酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种阿魏酸酯酶及其制备方法和应用，该来源于土壤宏基因文库的阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该基因含有极为罕见的四肽SXXK基序，将该酯酶基因插入到质粒pET28a(+)后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中实现异源表达。纯化后的重组酶(DLFae4)分子量为38.3kDa。此外，本发明首次提出新型阿魏酸酯酶可以水解氨苄青霉素、青霉素和头孢唑林等多种内酰胺类抗生素。定点诱变实验表明DLFae4的催化三联体由丝氨酸(S11)，组氨酸(H74)和天冬氨酸(D302)组成，三者中任何氨基酸的突变都会导致DLFae4失去催化能力。DLFae4对阿魏酸甲酯具有高水解活性，且具有良好的热稳定性。在纤维素酶的存在下，DLFae4可明显提高从去淀粉麦麸中释放阿魏酸的量。本发明的新型阿魏酸酯酶，由于其特有的活性及酶学特性，使其可应用于饲料、造纸、食品、制药等领域。

技术领域

本发明属于生物工程领域，包括一种新型阿魏酸酯酶及其制备方法和应用，具体涉及到阿魏酸酯酶的宏基因筛选技术、新型阿魏酸酯酶基因的重组、表达，阿魏酸酯酶的制备及其应用。

背景技术

阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，FAE，EC 3.1.1.73),也称肉桂酸酯酶，属于水解酶家族中的羧酸酯酶亚类，可以水解碳水化合物和酚酸之间的酯键，并释放酚酸，如阿魏酸(ferulic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、香豆酸(p-coumalic acid)等，这些酚酸具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、抗血栓、抗动脉粥样硬化等良好的生理功能。由于阿魏酸酯酶的这种特性，使得它在食品、制药、化妆品、动物饲料、纸浆和造纸工业，以及生物燃料生产等方面有着广泛的应用前景。

阿魏酸酯酶来源广泛，存在于植物、真菌和细菌中。大多数分泌的阿魏酸酯酶来源于微生物，已发现的菌株有黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，梭菌(Clostridium thermocellum)、乳酸杆菌(lactobacilli)等。研究表明阿魏酸酯酶与其他水解酶(纤维素酶、木聚糖酶等)之间存在协同作用，能提高植物细胞壁降解率和木质纤维素的糖化效率。

现阶段阿魏酸酯酶的研究方法有发酵提取法和异源表达法。前者是以可溶性的羟基肉桂酸酯类化合物(如阿魏酸乙酯等)或者富含阿魏酸的农业原料(如甜菜浆、燕麦木聚糖)为底物和酶诱导剂，筛选产阿魏酸酯酶的活性菌株并从该菌株的发酵产物中得到阿魏酸酯酶，然而，这种阿魏酸酯酶活性响应度低，酶活通常小于1U/ml，极大限制了该类酶在工业中的广泛应用。后者是通过分子克隆的方法，重组阿魏酸酯酶基因使其能够在合适的异源宿主中表达(如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、丝状真菌等)，经分离纯化得到重组酶。两种方法相比，异源表达法能够明显提高酶的产量和酶的活性。

传统的阿魏酸酯酶的筛选方法基于可培养微生物的纯化与筛选，以能否降解特定底物为筛选标准，但是自然界中有超过99％的微生物无法在实验室条件下培养，到目前为止自然界中仍然存在大量未发现的阿魏酸酯酶基因。随着生物信息学和分子生物学的发展，宏基因组学逐渐兴起，这种科学技术可广泛应用于不可培养微生物基因簇的发掘，有效绕开微生物传统分离培养的环节。宏基因组学技术不依赖于传统分离培养，直接提取环境中所有微生物的基因组DNA，克隆到载体并转化至易培养的宿主，构建宏基因组文库。文库包含了样本中可培养和不可培养微生物的全部核酸信息，利用序列筛选或功能筛选的方式可从文库中获得有用的目标产物，如酶、抗生素和活性物质等。宏基因组技术已成功地从荷斯坦牛瘤胃、污泥渗滤液、白蚁肠道菌群及土壤等不同样本中鉴定了新型的阿魏酸酯酶，这充分说明宏基因组学是挖掘和发现新型阿魏酸酯酶的一种有力工具。进一步，生物信息学技术的发展为提高酯酶的性能提供了更多的可能，如同源建模来进行虚拟筛选，设计定点诱变实验或理性的改造氨基酸序列。

发明内容