[发明专利]荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法

说明书

本发明涉及一种水体污染物检测方法，特别涉及一种荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法，属于分子生物学领域。本发明通过检测水生昆虫宜兴宽基蜉线粒体基因nad4L表达水平对吡虫啉的应答反应来进行吡虫啉污染监控的技术，具体实施步骤如下：（1）待检测水样的宜兴宽基蜉的培养；（2）总RNA的提取；（3）凝胶电泳检测；（4）RNA浓度测定；（5）RNA反转成cDNA；（6）标准品构建与标准曲线的制作；（7）基因表达量测定；（8）数据分析。该方法灵敏度高，时效性好，特异性强，操作简单，能快速检测水体是否受吡虫啉污染。

技术领域

本发明涉及一种水体污染物检测方法，特别涉及一种荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法，属于分子生物学领域。

背景技术

吡虫啉属于新烟碱类农药，是一种能使昆虫保持兴奋或麻痹继而死亡的神经性杀虫农药。它对无脊椎动物的高毒性、易用性、灵活性以及长期持久性等特点，使其成为全球市场占有率较高的一类杀虫农药。以吡虫啉为代表的这类农药对鸟类、蜂类等陆生及大型底栖动物、蜉蝣稚虫等水生无脊椎动物具有致死或亚致死影响，引起蚯蚓繁殖力下降等，影响生态平衡。同时，由于它们具有较好的水溶性及高浸出率而易于通过农业区域的径流和排水系统进入水生生态系统，对水环境的影响较大，威胁人类健康和水生生态系统。研究表明，新烟碱类农药已在全球环境中广泛分布并积累，水体、土壤、作物及动物体都受到了不同程度污染。因此，及时做好吡虫啉水体污染检测，并加以治理显得十分重要，而目前关于吡虫啉的检测主要针对于蔬菜中的残留，而对环境水体中吡虫啉的检测方法相对较少。

发明内容

为解决吡虫啉水体污染检测问题，本发明提供一种荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法，通过实时荧光定量PCR技术测定水生昆虫宜兴宽基蜉线粒体基因表达水平，来快速检测水体是否受吡虫啉污染，具有方便快捷，灵敏度高，操作简单等特点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)待检测水样的宜兴宽基蜉的培养

利用踢网法采集未受吡虫啉污染水域的宜兴宽基蜉稚虫，进行实验室饲养，建立用于吡虫啉污染研究的实验材料；

同时采集待测水样地水样，取宜兴宽基蜉于待测水样中培养24h；

(2)总RNA的提取对在待测水样中培养24h后的宜兴宽基蜉进行总RNA的提取；

(3)琼脂糖凝胶电泳检测验证样本总RNA提取成功；

(4)RNA总浓度的测定

用微量紫外分光光度计经过无RNA酶的去离子水调零之后测定RNA浓度，以及A260/A280；RNA浓度大于60ng/μL，A260/A280在1.9-2.2之间，说明浓度测定数据可信，可以进行反转实验；

(5)RNA反转为cDNA

(6)标准品的构建和标准曲线的制作

①配制PCR反应液

将cDNA模板分别用EASY Dilution进行1、10、100、1000、10000倍梯度稀释；

PCR反应液配置在冰上进行，20μL PCR反应液中包含终浓度为1x的SYBR PremixEx Taq II(2x)(Tli RNaseH Plus),Bulk、0.4μM PCR Froward Primer和0.4μM PCRReverse Primer；

②PCR反应