[发明专利]荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法

权利要求书

1.一种荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）待检测水样的宜兴宽基蜉的培养

利用踢网法采集未受吡虫啉污染水域的宜兴宽基蜉稚虫，进行实验室饲养，建立用于吡虫啉污染研究的实验材料；

同时采集待测水样地水样，取宜兴宽基蜉于待测水样中培养24 h；

（2）总RNA的提取 对在待测水样中培养24 h后的宜兴宽基蜉进行总RNA的提取；

（3）琼脂糖凝胶电泳检测 验证样本总RNA提取成功；

（4）RNA总浓度的测定

用微量紫外分光光度计经过无RNA酶的去离子水调零之后测定RNA浓度，以及A260/A280；RNA浓度大于60 ng/μL，A260/A280在1.9-2.2之间，说明浓度测定数据可信，可以进行反转实验；

（5）RNA反转为cDNA

（6）标准品的构建和标准曲线的制作

① 配制PCR反应液

将cDNA模板分别用EASY Dilution进行1、10、100、1000、10000倍梯度稀释；

PCR反应液配置在冰上进行，20 μL PCR反应液中包含终浓度为1x的SYBR Premix ExTaq II(2x) (Tli RNaseH Plus),Bulk、0.4 μM PCR Froward Primer和0.4 μM PCRReverse Primer；

② PCR反应

将配置好的反应液置于实时荧光定量PCR仪中反应，反应程序为95 ℃预变性30 s，然后进入如下循环：95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s，循环40次；利用电脑进行数据统计，观察熔解曲线以及标准曲线情况；熔解曲线为单峰，标准曲线R²值大于0.980，E值在90-110之间，说明标准曲线可用；

（7）基因表达量测定

配制荧光定量PCR反应液，反应程序为95 ℃预变性30 s，然后进入如下循环：95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s，循环40次，计算机统计各样本nad4L基因的相对表达量；

（8）数据分析

利用SPSS或Excel进行t检验，观察其表达量与未受吡虫啉污染的宜兴宽基蜉是否存在显著性差异，若存在显著性差异，说明水体极有可能受到了吡虫啉污染，若不存在显著性差异，则说明水体未受吡虫啉污染；

根据宜兴宽基蜉线粒体nad4L基因设计得荧光定量引物YXKJ-nad4L是

YXKJ-J-nad4L：5’-CGTAAGCATTTATTGGGTAT-3’；

YXKJ-N-nad4L：5’-AGACTGAAAGACCTAAAGCC-3’；

根据宜兴宽基蜉β-actin基因设计得荧光定量引物YXKJ-actin是YXKJ-J-actin：5’-CTTCCTTCCTGGGTATGG-3’， 其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

YXKJ-N-actin：5’-GCGGTGATTTCCTTCTGC-3’， 其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤（2）总RNA的提取，采用TaKaRaMini BEST Universal RNA Extraction Kit 试剂盒进行RNA提取。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤（3）琼脂糖凝胶电泳检测方法是：

① 配制1% 琼脂糖凝胶，取琼脂糖0.4 g、0.5×TBE液40 mL置于锥形瓶中，混匀后微波炉加热至琼脂糖完全溶解，室温冷却至50 ℃，加入2 μL Gold View核酸染色剂，混匀后倒入制胶板中静置20 min；

② 分别吸取Marker和各样本总RNA 各4 μL于点样孔内，凝胶板置于电泳槽中，由负极到正极方向120 V电泳30 min；

③ 将凝胶置于凝胶成像系统中进行检测，观察各泳道是否出现18S、28S rRNA条带，出现目的条带则表明样本总RNA提取成功。