[发明专利]一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法

说明书

本发明涉及一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，是通过对待测水样进行富集浓缩、丙酮溶解、密度梯度分离、提取DNA、数字PCR定量，通过贾第鞭毛虫体内拷贝数与初始DNA浓度换算机理进行换算，得出检测的贾第鞭毛虫的最低个数。结果显示，该方法对贾第鞭毛虫定量可低至0.233个，回收率可达27.15％。该方法选择特异性扩增引物，采用优化的DNA提取条件，利用检测限更低、更灵敏的数字PCR技术进行定量。该方法在优化试剂使用和实验条件的同时，缩短实验时间，提高方法的灵敏度和稳定性。本发明方法特别适用于饮用水中少量贾第鞭毛虫的快速检测，可用于应急监测，具有广阔的推广前景。

技术领域

本发明涉及一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，涉及分子生物学及基因检测技术领域。

背景技术

贾第鞭毛虫是一种常见的病原微生物，由于常规水处理工艺难以完全将其去除，对氯消毒又有很强的耐受性，加之其感染剂量很低，常以水介传播导致人群感染，从而引起了国际社会的广泛关注和高度重视。

我国《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)规定贾第鞭毛虫不得高于1个/10L。我国现行的《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12-2006)是参照美国环保局(USEPA)推荐的1623方法(815-R-05-002)滤囊/滤芯过滤-免疫磁分离方法-镜检法，不仅进行富集浓缩步骤操作繁琐、耗时长，回收率达到10％以后即认为方法合格，而且滤囊/滤芯及免疫磁珠均为一次性进口耗材，检测成本非常高。改进的膜过滤-密度分离梯度分离法-镜检法大幅度降低了检测成本，贾第鞭毛虫回收率虽然提高至56％，但仍存在镜检耗时耗力、自发荧光颗粒干扰等问题。

随着现代分子生物学技术的发展，定量PCR(简称qPCR)技术以快速、敏感、特异性强等特点备受青睐。研究表明qPCR技术应用于水中病原微生物的检测不仅提高检测灵敏度，缩短实验周期，还可实现批量检测，尤其适用于集团性突发水污染事件调查。目前，传统的qPCR技术在低拷贝靶分子、低模板浓度差异中灵敏度和精确度仍然相对较差，新兴的数字PCR技术则采用高密度纳升流控芯片技术，可实现低至单拷贝样品的检测，大幅度提高检测灵敏度，同时具有变异度低、可精确定量的优点。因此，开发一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法非常必要。

发明内容

本发明的目的就是为了解决传统镜检法耗时耗力及存在藻类、荧光颗粒干扰的缺点，克服传统qPCR检测技术在低拷贝靶分子检测、低模板检测的灵敏度和精密度的差异相对较大的不足，建立一种基于高密度纳升流控芯片的数字PCR技术，实现低含量、高通量检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，该发明选择特异性扩增引物，优化DNA提取条件，确定数字PCR的最低检测限。该发明是一种灵敏度高、批量性、规范化检测水中贾第鞭毛虫的技术，能够对单拷贝DNA进行准确定量。

本发明解决上述问题的技术方案如下：基于数字PCR技术检测饮用水中贾第鞭毛虫，包括以下步骤：

首先，利用盘式过滤器和醋酸纤维膜对水样进行富集，利用丙酮对膜进行溶解，浓缩至EP管中。其次，利用percoll-蔗糖溶液对水样浓缩液进行纯化分离，捕获其中的贾第鞭毛虫；第三，利用QIAamp DNA mini kit作为优选的DNA提取试剂盒提取贾第鞭毛虫的DNA；第四，利用优选的芯片和预混液以及特定的反应体系和反应程序对提取DNA进行数字PCR检测。

根据贾第鞭毛虫体内拷贝数与初始DNA浓度换算机理进行换算，得出环境样品的贾第鞭毛虫的个数和回收率：

N_G＝C×S/16 (1)

注：N_G——贾第鞭毛虫的个数；C——所测样品基因拷贝数；S——样品DNA体积与加入模板体积的比值。

回收率＝(加标水样基因量-阴性对照基因量)/实际标样基因量×100％ (2)