[发明专利]一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法在审
| 申请号： | 201910117851.7 | 申请日： | 2019-02-15 |
| 公开（公告）号： | CN109609670A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 李红岩;李罗英;张艳芬;于志勇;李洁;郑蓓 | 申请（专利权）人： | 中国科学院生态环境研究中心 |
| 主分类号： | C12Q1/6893 | 分类号： | C12Q1/6893;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 100085*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 数字PCR 快速检测 饮用水 换算 特异性扩增引物 丙酮溶解 方法选择 密度梯度 实验条件 试剂使用 应急监测 提取DNA 拷贝数 灵敏度 检测 富集 可用 水样 回收率 优化 灵敏 浓缩 体内 | ||
1.一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于利用数字PCR技术对待测水样中富集浓缩后的贾第鞭毛虫提取的DNA进行检测，检测低至单拷贝样品，提高检测灵敏度，而且可对样品进行批量检测，缩短实验时间，降低实验成本。
2.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于采用Φ142mm的盘式过滤器和最大孔径为47μm的Φ142mm醋酸纤维膜对待测水样进行富集浓缩，利用丙酮对膜进行溶解，密度梯度分离法获得贾第鞭毛虫，此方法降低成本，有利于技术的广泛推广。
3.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于选择特定性引物GDF和GDR。
4.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于提取DNA采用液氮/沸水冻融法：将ATL裂解液与收集的贾第鞭毛虫悬浊液以2.5:1比例混合均匀，液氮中冷冻2min，沸水中破壁2min，5个循环，该DNA提取方式既可破坏孢囊结构又不影响DNA后续扩增效率。
5.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于采用试剂和耗材为：QIAamp DNA mini kit作为DNA提取试剂盒，Digital PCRMaster Mix v2作为DNA扩增混合液，Digital PCR V2 20K Chip 12-PA为PCR反应的芯片。
6.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其所述的数字PCR检测贾第鞭毛虫DNA采用反应体系为14.5μl，其中含有3D digital PCRMaster Mix 7.25μl，上游、下游引物(10μmol/L)各1.3μl，探针(10μmol/L)0.363μl，DNA模板4.287μl，该试验每个样品均做3个平行样，每次试验同时设置无模板阴性对照。
7.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其所述的数字PCR检测贾第鞭毛虫DNA采用特有的反应程序：在96℃下预变性10min；60℃时退火/延伸2min，98℃变性30s，39个循环；60℃退火2min，10℃保持∞。
8.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于对于单拷贝样品的检测，具有很高的准确性和精度。
9.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术快速检测饮用水中贾第鞭毛虫的方法，其特征在于可对样品的DNA进行高通量检测。
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