[发明专利]一种离子液体提取细胞膜蛋白的方法及试剂盒

说明书

一种从生物样品中提取膜蛋白的方法，包括如下步骤：1.将组织切成小块，使用TBS缓冲液反复清洗，除去不相关部分；2.对切成小块的组织进行机械匀浆，3.加入裂解缓冲液进行细胞裂解，离心弃上清，取沉淀加裂解缓冲液重悬4.重悬后的沉淀中加入离子液体提取液提取膜蛋白后离心，膜蛋白位于离心层的上清液中，真空低温蒸发离子液体后得到膜蛋白。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学领域，具体涉及一种离子液体提取细胞膜蛋白的试剂盒。

背景技术

蛋白质作为生物膜的重要组成成分，是生物膜功能的主要承载者。并且膜蛋白质也是重要的药物靶点，其功能异常与多种疾病直接相关，在目前的药物开发中，约有70% 的药物靶点为膜蛋白。然而，膜蛋白质的难以溶解以及低丰度等问题一直是制约膜蛋白质组发展的瓶颈。

目前现有的以尿素为代表的变性剂、甲醇为代表的有机试剂及以十二烷基磺酸钠为代表的表面活性剂等膜蛋白质溶解体系，存在着无法同时满足强溶解能力和好的酶活兼容性及溶解试剂去除困难，干扰后续液相分离-质谱鉴定等问题。因此，发展一种溶解能力强、酶活兼容性好且不干扰后续

的色谱分离和质谱鉴定的新型膜蛋白质溶解体系，对于膜蛋白组学的研究具有重要意义。

离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的、在室温或室温附近呈液态的盐类。室温离子液体, 又称离子液体, 是一种在室温及接近室温的环境中完全以离子状态存在的液态物质. 由于其具有不可燃、蒸汽压极低、黏度大、导电性和溶解能力好、高温稳定等特点, 已被广泛应用于有机合成、催化、电化学、分析化学等领域. 离子液体具有一些传统有机和无机化学试剂不可比拟的优点, 如蒸汽压极低、不易挥发、黏度大、不可燃、导电性和溶解能力好、高温稳定、电化学窗口较宽等。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题而提供。

本发明通过以下技术方案实现：1.在冰上将组织切成小块，使用预冷到4℃的TBS缓冲液反复清洗，除去不相关部分；2.对切成小块的组织进行低温机械匀浆，3.加入裂解缓冲液进行细胞裂解，离心弃上清，取沉淀.沉淀中加入裂解缓冲液重悬，4.重悬后的沉淀加入离子液体提取液提取膜蛋白后离心，膜蛋白位于离心层的上清液中，真空低温蒸发离子液体后得到膜蛋白。试剂盒组分包括：提取缓冲液，离子液体试剂，蛋白酶抑制剂混合液。裂解缓冲液成分为：300mM蔗糖，15 mM NaCl，10 mM Pipes (哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸）),0.5mMEDTA, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 0.025%洋地黄皂苷，pH 7.4；TBS: 50 mM Tris，150 mM.NaCl，pH 7.4。蛋白酶抑制剂混合液购自碧云天生物技术。提取缓冲液为离子液体是1-十二烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C12MIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐(VEIMBF4),1-乙烯基-3-乙基咪唑三氟甲烷磺酰亚胺盐(VEIMNTF2)或其混合物，或包含所述与水混溶的离子液体和水的混合物。

具体方法为：在分离目标组织后，快速去除不需要的物质（例如结缔组织，脂肪，血管等）。将组织快速切成约2 mm³的碎片。 将组织切片加入含有2ml冰冷TBS的试管中。轻轻地轻弹管子以去除血细胞和其他松散附着的物质。通过在4℃下以100×g离心2分钟来收集组织块。 去除并丢弃上清液。

收集组织小块，转移到预先冷却的均化器中进行机械匀浆获得细胞后，用裂解缓冲液液将细胞在冰上裂解15分钟。裂解过程加入蛋白酶抑制剂混合液防止蛋白降解，4℃低温1000g离心15分钟后，弃上清后收集沉淀。用裂解缓冲液将沉淀重悬，加入离子液体或其混合液进行膜蛋白提取，离子液体为1-十二烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C12MIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐(VEIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑三氟甲烷磺酰亚胺盐(VEIMNTF2)或其混合物，充分离心后，取上清，即为膜蛋白溶液，蛋白浓度用Bradford试剂测定。

附图说明