[发明专利]一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法

说明书

本发明公开了一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法，包括以下步骤：(1)取林木组培苗的根为外植体，将外植体在含有生长素NAA的B5培养基中培养20‑26h；(2)将步骤(1)培养后的外植体转入含有细胞分裂素2‑IP的B5培养基中培养10‑14天；(3)将步骤(2)培养后的外植体转入含有细胞分裂素6‑BA的MS培养基中培养14‑18天，获得再生芽。本发明的林木芽再生方法不经过愈伤组织阶段直接形成茎端分生组织，从而产生再生芽，因此适用于建立研究植物细胞命运决定、谱系转变等科学问题的实验体系，适用于难以形成具有再生能力愈伤组织的物种建立芽再生体系，进而进行离体快繁、遗传转化或其他生物技术操作。

技术领域

本发明涉及植物再生技术领域，具体涉及一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法。

背景技术

被子植物的茎端分生组织位于茎的顶端，呈突起的穹顶结构，其细胞分裂和分化活动形成了整个地上部分。根据其内部细胞的结构特征可以将茎端分生组织分为三个不同的区域，即中心区域、周围区域和肋状区域(Meyerowitz,Cell,1997,88,299-308)。中心区域处在穹顶顶端的中心位置，包含一团分裂较慢的多能干细胞。干细胞分裂产生的子代细胞一方面进入四周毗邻的周围区域，参与包括花、叶在内的侧生器官的分化；另一方向下进入肋状区域，分化成茎的组成部分(Soyars et al.,Curr Opin Plant Biol 2016,29,163-168)。干细胞下方有一团被称为组织中心的细胞，发挥了调控干细胞维持的作用。茎端分生组织受到严密而精确的分子遗传调控，关键基因的时空特异性表达、细胞分裂与分化的动态平衡共同维持其特定的结构和功能(Aichinger et al.,Annu Rev Plant Biol,2012,63,615-636)。

在离体培养条件下，成熟的组织器官能够重新形成茎端分生组织，进而再生芽并产生新的植物个体(Sang et al.,New Phytol,2018,218,1334-1339)。在这一过程中，生长素和细胞分裂素发挥了至关重要的调控作用。最近的研究发现，芽再生过程中外植体中的中柱鞘和类中柱鞘细胞受到外源生长素诱导，形成具有根端分生组织细胞性质的愈伤组织。发明人前期的工作表明，转入分化培养阶段后，愈伤组织特定区域内生长素和细胞分裂素响应信号形成特定分布模式，细胞分裂素响应信号位于中心区域，而生长素在其周围呈环状分布(Cheng et al.,Plant Physiol,2013,161,240-251)。处在中心区域的细胞分裂素通过其信号转导途径中的B类Arabidopsis Response Regulator蛋白直接激活茎端干细胞特征决定基因WUSCHEL的表达，同时抑制生长素在该区域的积累，从而推动愈伤组织细胞发生命运转化，形成茎端分生组织(Meng et al.,Plant Cell,2017,29,1357-1372)。

芽再生是植物离体快繁和基因工程操作的先决条件，是作物林果花卉标准化生产的重要途径，对于发展智能农业和生物育种具有十分重要的意义(Sang et al.,TrendsPlant Sci,2018 23,660-666)。以杨树为代表的林木多为异花授粉，遗传背景高度杂合，不利于保持亲本优良性状。因此，基于器官再生的组织培养对于林木的繁殖和高产优质栽培体系的建立尤为重要。但是，多数具有重要经济价值的林木由于难以形成愈伤组织或愈伤组织不能进一步分化，无法建立芽再生体系，严重制约了生物技术在农林业中的应用发展。

发明内容

针对上述现有技术的情况，本发明的目的是提供一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法。本发明的林木芽再生方法是由侧根原基中的根端分生组织直接转分化形成茎端分生组织，不经过愈伤组织诱导和培养阶段，适用于建立研究植物细胞命运决定、谱系转变等科学问题的实验体系；适用于难以形成具有再生能力愈伤组织的物种建立芽再生体系，进而进行离体快繁、遗传转化或其他生物技术操作。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：