[发明专利]一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系

说明书

本发明属于绿色化学技术领域，提供了一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系。本发明发现了来自红球菌Rhodococcus erythropolis CCM2595的腈水合酶在催化脂肪族二腈方面的全新应用。尤其该酶可选择性催化己二腈生成5‑氰基戊酰胺，反应速率高，反应条件简单温和，为5‑氰基戊酰胺的工业生产提供方法。

技术领域

本发明属于绿色化学技术领域，具体涉及来源于红球菌RhodococcuserythropolisCCM2595的腈水合酶在区域选择性催化脂肪二腈生成氰基酰胺方面的应用。

背景技术

腈水合酶(EC4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase)是一类催化腈类化合物生成酰胺类化合物的金属酶。腈水合酶可催化腈类物质生产丙烯酰胺，烟酰胺、5-氰基戊酰胺等，在精细化学品尤其是农药和有机溶剂生产中应用广泛。腈类物质主要通过其生产单位的污水排放，除草剂或是意外泄露等方式进入人们生活。许多腈类都具有神经毒性，可使人或动物致癌、致畸。因此腈水合酶在环保领域也有重要作用，可以降解环境中的腈类物质。

5-氰基戊酰胺(5-CVAM)可用于合成唑啶草酮和6-氨基己酰胺，其中唑啶草酮可用于植物种子出土前的除草剂，6-氨基己酰胺是合成己内酰胺的重要中间体，己内酰胺是重要的化工原料。5-氰基戊酰胺可通过化学催化或生物催化己二腈发生水合反应予以制备。己二腈中含有2个氰基，要求催化剂能够区域选择性水合1个氰基生成5-氰基戊酰胺。相比于化学催化法反应条件苛刻(高温高压铜催化等)同时伴有大量副产物生成，生物催化具有反应快速温和、专一性强、选择性高、经济环保等优点。

目前根据权威生物合成催化酶数据库BRENDA表明，具有区域选择性能够部分催化己二腈生成5-氰基戊酰胺的微生物非常少，仅有假单胞菌属Pseudomonas chlororaphis。因此发现可用于工业快速高效生产5-氰基戊酰胺的新型腈水合酶是十分重要的。

本发明选用的Rhodococcuserythropolis CCM2595属红球菌，目前仅被报道具有降解苯酚衍生物的能力[Strnad H,Patek M,Fousek J,Szokol J,Ulbrich P,Nesvera J,Paces V,Vlcek C:Genome Sequence of Rhodococcuserythropolis Strain CCM2595,aPhenol Derivative-Degrading Bacterium.Genome announcements 2014,2(2)]，而其对脂肪族二腈的腈水合催化反应尚未有报道。

发明内容

本发明提供了来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶在催化脂肪二腈生成氰基酰胺方面的应用。

本发明的技术方案：

一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系，腈水合酶菌体浓度1-3g/L,底物脂肪二腈终浓度20-50mM/L,转化体系为pH 7-8PBS缓冲溶液,25℃、200rpm振荡反应,反应5min后加入等反应体积甲醇终止反应，离心后取上清液，经过滤后进行高效液相色谱检测,对氰基酰胺产物生成的选择性大于90％。具体步骤如下：

(1)质粒构建：来源于红球菌RhodococcuserythropolisCCM2595的腈水合酶的核苷酸序列为：