[发明专利]一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系

权利要求书

1.一种新型腈水合酶高效催化脂肪族二腈水合反应的方法，其特征在于，含有来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶的菌体的浓度为1-3g/L,底物脂肪族二腈终浓度20-50mM/L,转化体系为pH 7-8PBS缓冲溶液,25℃、200rpm振荡反应，反应5min后加入等反应体积甲醇终止反应，离心后取上清液，经过滤后进行高效液相色谱检测,氰基酰胺选择性大于90％；编码所述的腈水合酶的核苷酸序列为序列表中序列1所示；

所述的脂肪族二腈为己二腈。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有所述的腈水合酶的菌体制备步骤如下：

(1)质粒构建：来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶的基因序列由2596个核苷酸组成，以质粒pET-24a(+)为表达载体，根据其酶切位点特性，选择NdeI和HindIII酶切位点插入编码所述腈水合酶的基因序列，编码所述腈水合酶的基因序列来源于经过PCR得到的纯化产物；经过酶切后对相应DNA片段进行回收纯化，选用lacI启动子，加入卡那霉素KanR抗性基因片段，选用T7终止子，转化大肠杆菌TOP10，重组质粒经过酶切验证后命名为G0130349-1；

(2)蛋白表达验证：将步骤(1)中得到的重组质粒平行转化入BL21(DE3)和ArcticExpression(DE3)两种大肠杆菌感受态细菌中，加入LB液体培养基扩增培养后分别涂布于含50μg/ml卡那霉素(Kan)的LB固体平板，37℃倒置培养24h；分别挑取平板上单菌落接种于LB液体培养基中，培养至OD值为0.6-0.8时加入终浓度为0.1-1mM/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导3-24h；诱导完成后，离心收集菌体，洗涤后超声破碎菌体，进行SDS-PAGE分析，验证NHase蛋白表达情况；

(3)制备菌液：挑取步骤(2)中Arctic Expression(DE3)平板上单菌落接种于少量含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养12-18h得种子液；将种子液按体积1％接种量继续接种到含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.1mM/L，16℃、220rpm振荡培养24h得发酵液；离心去上清收集菌体，用pH7-8的PBS缓冲液洗涤2-3次后重新悬浮，得待用菌液。

3.如权利要求1所述方法中来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶在催化己二腈反应中的应用。

4.如权利要求1所述方法中来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶在制备5-氰基戊酰胺中的应用。