[发明专利]一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种合成2'‑岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过在基因组上强化表达乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2'‑岩藻糖基乳糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,hMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸盐藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供体。再经过岩藻糖基转移酶的催化，将岩藻糖作为活化基团转移到乳糖上，岩藻糖通过α-1,2糖苷键与半乳糖相连，形成2'-岩藻糖基乳糖。

随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的GDP-L-fucose。在化学合成中，GDP-L-fucose以L-岩藻吡喃糖基四乙酸为起始原料，由HBr、Ag₂CO₃、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。GDP-L-fucose是可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途径：补救途径和从头途径。两种途径都需要乳糖作为底物，但是枯草芽孢杆菌对乳糖的利用能力有限。

因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成2'-岩藻糖基乳糖，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成2'-岩藻糖基乳糖。

具体的，一方面，本发明提供了一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。

枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因是不表达的，通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中插入外源乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2'-岩藻糖基乳糖的合成。其中，将P43表达的大肠杆菌乳糖运输酶基因lacY重组在枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶amyE位点，来在枯草芽孢杆菌168的基因组中插入外源乳糖运输酶基因。强启动子P43在枯草芽孢杆菌168中过表达了外源乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度。

进一步的，将P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。所述乳糖运输酶基因如NCBI中Gene ID:949083所示。