[发明专利]用于富集低频DNA突变的DNA探针应用于多种突变的同时检测

说明书

本发明公开了用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用。该探针具有如下序列的至少之一：1)SEQ ID NO:1～6所示的核苷酸序列；以及2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。该探针可以同时检测对待测核酸样品中变异频率极低的突变，即EGFR基因19外显子上的多种缺失突变，进行特异性的富集，进而实现上述低频突变的特异性检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用，更具体地，本发明涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针、探针在制备试剂盒中的用途、试剂盒、富集低频DNA突变的方法以及检测低频DNA突变的方法。

背景技术

肺癌有很高的发病率和死亡率，它的发病率在美国是第二位，在中国是第一位，死亡率在美国和中国都是第一位。除了吸烟者，很多从未吸烟的人因为遗传和环境的因素也患有肺癌。肺癌患者中有85-90％的病例是非小细胞肺癌。近年来经大量研究，科学家对于这一类肺癌患者所携带的基因突变情况也有了更为清楚的认识。

人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)稳定表达于多种上皮组织以及间质和神经元组织中，对细胞的生长、分化的调节有重要作用。当表皮生长因子(EGF)与EGFR结合时，可以使EGFR的胞内区活化，并且激活多种媒介物质，启动繁杂的信号通路。因此，EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。目前，临床上针对肺癌EGFR的靶向治疗，主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂，如贝达药业的埃克替尼(凯美纳)，阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)等。

研究表明，肺癌患者的EGFR基因编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，而这些突变与埃克替尼和吉非替尼等药物的临床疗效有关，即小分子酪氨酸激酶抑制剂能够竞争性抑制ATP与EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基的磷酸化，抑制EGFR下游信号转导。目前，虽然已经在EGFR基因外显子18-21上发现不下30种突变，但85％-90％的突变都是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变。与 EGFR 21号外显子上的L858R点突变不同，19号外显子上的缺失突变存在近30种类型，有研究表明，尽管19号外显子的缺失突变类型不同，但大部分都能够响应靶向药物。因此，对多种EGFR 19外显子的突变进行检测对于肺癌患者来说至关重要。

因此，对于EGFR 19外显子的突变的检测技术仍需要进一步开发和改进。

发明内容

本发明目的是至少在一定程度上解决相关的技术问题之一。为此，本申请的发明人设计了一组DNA探针，对微量血液或其他体液游离DNA突变进行特异性的捕获富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤DNA变异。利用该探针检测肺癌患者EGFR 基因19外显子上的多种缺失突变类型，并且实现多种突变类型的同时检测。同时，发明人还提出了一种无创、高灵敏度、高特异性的同时检测肺癌患者EGFR 19外显子多种突变类型的检测方法，通过使用特殊设计的DNA探针，对肺癌患者外周血或其他体液游离DNA (cfDNA/ctDNA)中的EGFR 19外显子突变进行特异性的富集，能够应用在肺癌患者靶向用药指导，靶向治疗期间的动态监控等。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于富集低频DNA突变的DNA探针。根据本发明的实施例，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQ ID NO:1～6所示的核苷酸序列；以及2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。

atgttttgat(SEQ ID NO:1)。

gatgtcttga(SEQ ID NO:2)。

ctttcgattcc(SEQ ID NO:3)。

gttggttcct(SEQ ID NO:4)。