[发明专利]用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用

权利要求书

1.一种富集低频DNA突变的DNA探针，其特征在于，所述探针具有如下序列的至少之一：

1)SEQ ID NO:1～4所示的核苷酸序列，

2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述探针具有LNA修饰；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及第八位核苷酸上；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸以及第八位核苷酸上；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上；

任选地，所述探针5’端具有生物素标记；

任选地，所述探针3’端具有磷酸修饰。

3.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述探针具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因20号外显子发生S7681突变的样本；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因21号外显子发生L861Q突变的样本；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述探针用于富集BRAF基因发生V600E突变的样本。

4.权利要求1～3任一项所述的富集低频DNA突变的DNA探针在制备试剂盒中的用途，所述低频DNA突变为癌症相关突变，所述试剂盒用于诊断肺癌或指导用药。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述癌症相关突变为EGFR基因20号外显子发生S7681突变、EGFR基因21号外显子发生L861Q突变或BRAF基因发生V600E突变。

6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的DNA探针。

7.一种富集低频DNA突变的方法，其特征在于，包括：

1)对DNA片段进行第一PCR扩增处理，以便获得第一PCR扩增产物；

2)对第一PCR扩增产物进行变性处理，以便获得变性产物；

3)将所述变性产物与权利要求1～3任一项所述的DNA探针进行杂交处理；

4)将杂交处理产物进行第二PCR扩增处理，以便获得第二PCR扩增产物，所述第二PCR扩增产物构成低频DNA突变集。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤3)之后、步骤4)之前，进一步包括：将所述杂交处理产物进行纯化处理；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述杂交处理是在31℃的条件下进行30min；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述杂交处理是在15℃的条件下进行30min；

任选地，所述纯化处理通过链霉素亲和性磁珠纯化进行的；

任选地，所述DNA片段来源于血液或其他体液游离ctDNA或cfDNA；

任选地，所述探针具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述第一PCR扩增和第二PCR扩增是通过巢氏PCR进行的。