[发明专利]一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法

权利要求书

1.一种提高L-山梨糖产量和生产强度的方法，其特征在于，敲除氧化葡萄糖酸杆菌L-山梨糖代谢副产物形成相关的基因；所述代谢副产物形成相关的基因为：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH和NADH-dependent ADH；所述GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述XDH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述ALDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GA-5-DH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；所述XDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述sDH SLC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PTS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述PQQ-dependent DH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述NADH-DH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述NADH-dependent ADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌为G.oxydansCGMCC 1.110。

4.一种产L-山梨糖的基因工程菌，其特征在于，以氧化葡萄糖酸杆菌为出发菌，敲除产L-山梨糖代谢途径中合成山梨糖的主要代谢副产物形成相关的基因；所述主要代谢副产物包括但不限于果糖；所述主要代谢副产物形成相关的基因为：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH–DH和NADH-dependent ADH；所述GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述XDH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述ALDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述GA-5-DH的核苷酸序列如SEQID NO.2所述的核苷酸序列；所述XDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述sDH SLC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PTS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述PQQ-dependent DH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述NADH-DH的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述NADH-dependent ADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

6.一种构建权利要求4或5所述基因工程菌的方法，其特征在于，分别扩增待敲除的目的基因在基因组位置上、下游各800～1200bp的序列，并与抗性基因和负向筛选标记基因融合，构建敲除框：左侧同源臂-抗性基因-负向筛选标记基因-右侧同源臂；将敲除框连接到载体上，转化至宿主的感受态细胞中；在含抗性标记物的培养基中进行首次筛选，并在含有负向筛选标记物类似物的培养基再次筛选。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗性基因为编码抗生素抗性的基因，；所述负向筛选标记基因为upp基因，所述负向筛选标记物类似物为5-氟尿嘧啶。

8.一种生产L-山梨糖的方法，其特征在于，将权利要求4～5任一所述的基因工程菌活化，接种至发酵培养基，在28～30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每L含有D-山梨醇280-350g，酵母膏0.4-0.6g，液体玉米浆1.5-2.5g，轻质碳酸钙0.5-1g。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述活化是将基因工程菌在种子培养基中培养，获得种子液；所述种子培养基每L含有：D-山梨醇180-200g，酵母膏6-8g，碳酸钙2-4g。