[发明专利]一种补料分批发酵枯草芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法

说明书

本发明公开了一种补料分批发酵枯草芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法，该包括：活化菌种，补料分批发酵培养，菌体破碎，提取粗酶液。本方法工艺简单，生产周期短，操作简便，与传统生产途径相比，上述芽孢杆菌所产的褐藻胶降解酶酶活力高，发酵效率高。

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，主要涉及的一种补料分批发酵枯草芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法。

背景技术

褐藻胶是由-1，4-甘露糖醛酸(M)和-1，4-古洛糖醛酸(G)不规则链接起来的线性长链分子，其通过裂解反应可以得到功能性寡糖即为褐藻寡糖。目前研究表明，褐藻寡糖具有抗癌、抗凝、降脂、免疫调节和抗衰老、促进植物生长等明显的功能性表现。因而得到了研究者的广泛关注。

目前获得褐藻胶寡糖的制备方法主要有物理降解、化学降解法和酶解法。物理降解主要通过紫外光照射、高温等手段制备，有着成本需求高，产物成分难以控制等缺点，化学降解法主要通过制造酸性环境或者碱性环境使得海藻胶裂解，存在产物不均一、重复性差、对环境污染程度大等缺点，而酶解法因效率高、时间段、产物成分易控制等优势成为近年来的主要研究方向。褐藻胶裂解酶主要存在于海洋细菌之中，如交替单胞菌(Alteromonas)，假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas)，海洋弧菌(Vibrio)等。然而，这些微生物的安全性难以得到保证，如某些海洋弧菌可能会引起败血症，且大多数海洋细菌培养时需要添加海水，生产地域受到限制、因而限制了这一类微生物的应用。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种补料分批发酵枯草芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法。

本发明的技术方案为：一种补料分批发酵枯草芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法，其具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌NJWGYHYH20130799接入液体培养基中活化，将活化好的菌种涂布于固体培养基中，长出菌落后挑选单菌落接入液体培养基中培养，得到种子液；

(2)补料分批发酵：将种子液接入发酵罐中发酵培养，发酵进行6～12h 时补料添加海藻酸钠，使浓度在10～16h内保持在20～40g/L；发酵进行3～5h时，每隔10～20min补料添加葡萄糖，使其浓度保持在 2～4g/L；发酵进行到第10～12h时，改成每隔30min～40min添加葡萄糖，使其浓度控制在0.5～2g/L，发酵进行22～32h时停止补料添加；控制温度、通气量、转速和pH值，发酵培养36～48h得发酵液；

(3)将上述发酵液在3～5℃下、经离心去除上清液后收集菌体，将收集的菌体进行破碎处理；随后将破碎液在3～5℃下离心去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。

上述步骤(1)中固体培养基为LB培养基；步骤(1)中活化和单菌落接入液体培养基的组分均为：海藻酸钠20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L，pH为6.5～7.5；装液量为容器体积的18～22％；活化和培养温度均控制在35～38℃；摇床转速均为 150～180r/min；培养16～24h后至对数中后期；活化时间为10～12h。

优选步骤(2)中种子液的接入量为发酵培养基体积分数比为 4～8％；发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％。

优选步骤(2)中补料添加海藻酸钠的浓度为50～80g/L；流加所用葡萄糖浓度为10～30g/L。