[发明专利]一种补料分批发酵枯草芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法

权利要求书

1.一种补料分批发酵枯草芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法，其具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌NJWGYHYH20130799接入液体培养基中活化，将活化好的菌种涂布于固体培养基中，长出菌落后挑选单菌落接入液体培养基中培养，得到种子液；

(2)补料分批发酵：将种子液接入发酵罐的发酵培养基中发酵培养，发酵进行6～12h时补料添加海藻酸钠，使浓度在10～16h内保持在20～40g/L；发酵进行3～5h时，每隔10～20min补料添加葡萄糖，使其浓度保持在2～4g/L；发酵进行到第10～12h时，改成每隔30min～40min添加葡萄糖，使其浓度控制在0.5～2g/L，发酵进行22～32h时停止补料添加；控制温度、通气量、转速和pH值，发酵培养36～48h得发酵液；

(3)将上述发酵液在3～5℃下、经离心去除上清液后收集菌体，将收集的菌体进行破碎处理；随后将破碎液在3～5℃下离心去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中固体培养基为LB培养基；液体培养基的组分为：海藻酸钠20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L，pH为6.5～7.5；装液量为容器体积的18～22％；培养温度控制在35～38℃；摇床转速150～180r/min；培养16～24h后至对数中后期。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中种子液的接入量为发酵培养基体积分数比为4～8％；发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中补料添加海藻酸钠的浓度为50～80g/L；流加所用葡萄糖浓度为10～30g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中发酵培养基的组分为：海藻酸钠20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L，CaCO₃ 10～15g/L,K₂HPO₄ 0.8～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8～1.2g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.015～0.025g/L，MnCl₂·4H₂O 0.001～0.005g/L，pH为6.5～7.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中发酵的条件为：控制温度在35～38℃，通气量保持在3～5L/(L·min)，搅拌速率150～200r/min，pH值为6.5～7.5。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中发酵液和破碎液的离心转速均为10000～12000rpm/min，离心时间均为10～15min。