[发明专利]一种制备雌雄均高度不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物

说明书

本发明公开了一种制备雌雄均高度不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物。该方法包括：1)构建Vasa基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Vasa基因靶点和polyA；U6启动子，第二Vasa基因靶点和polyA；2)将所述构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，得G0代，自交得G1代；和，3)将所述G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配得G2代，即得。本发明利用基于PiggyBac转座子的CRISPR/Cas9技术成功构建了在不影响正常交配行为的前提下高度不育的鳞翅目昆虫，在鳞翅目害虫通过不育技术进行防治方面具有重要的价值。

本申请要求申请日为2018年02月07日的中国专利申请CN201810123478.1的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备雌雄均高度不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物。

背景技术

家蚕作为一种历史悠久的经济昆虫，在我国已有5000多年的养殖历史，其经济价值直到今天依旧在我国对外贸易中占有较高比重。如今，随着现代生物科技的快速发展，家蚕作为鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的代表，不但由于其在经济上的价值，更是由于其饲养方法成熟，生命周期短以及具有明显变态发育等生物学特征，逐渐成为一种重要的生物学模式生物。随着我国在21世纪初在世界上率先绘制完成了家蚕基因组框架图，对家蚕的研究逐渐进入后基因组学时代，近年来家蚕作为鳞翅目昆虫模式生物在家蚕生物反应器和鳞翅目害虫防治领域的研究中发挥重要作用。目前，鳞翅目作为农林业害虫最多的目，包括玉米螟(Ostrinia nubilalis)、小地老虎(Agrotis ypsilon)、棉铃虫(Heliothis armigera)等多种严重危害农林业的昆虫，并且每年带来巨大的经济损失。为了降低害虫造成的经济损失，对害虫的生物防治也随着生物技术的不断发展逐渐被人们所重视。生物防治由于其人畜安全，无污染，不形成抗性的特点，相较于化学防治对环境的损害，生物防治表现出巨大的优势。目前，生物防治中使用最广泛的是昆虫不育技术(SIT)，即通过辐射或杂交方法获得不育害虫后将其野外放生，通过与野生昆虫害虫交配使害虫后代减少从而降低害虫种群数量。在鳞翅目害虫的不育防治中存在获得完全不育需要很多偶的辐照剂量(一般需要300-500Gy)，而较高的辐照剂量会降低其交配竞争力，从而影响防治效果，因此在鳞翅目害虫的生物防治中，遗传不育方法日益受到重视。因此，家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，通过遗传操作获得大量不育个体对于未来鳞翅目害虫的防治具有重要意义。

目前，我国的家蚕不育技术主要是由中国农业科学院蚕业研究所研发的家蚕雄性不育系——镇江野败。该家蚕雄性不育品系是通过野桑蚕和家蚕远缘杂交育种的过程中，从后代中分离出来的不育品系，该品系后代时常出现不育症状。通过不断地传代筛选，最终得到了温敏型不育系No1和组成型不育系No2。温敏型不育系No1在春季的不育性为10％-90％，其少量可育后代在随后的夏季表现为100％不育，秋季表现为99％不育，No1不育性受到环境温度的影响较大。组成型不育系No2在春季不育性为95％至100％，其少数可育后代在随后的夏季和秋季均表现为100％高度不育，No2受环境温度影响不大。镇江野败作为一种家蚕雄性不育品系，与国外已报道的3种类型①雄蛾阴茎肌退化slp②精子缺乏slo③精荚异常sls相比，镇江野败具有高不育性和生殖系统发育异常多型性的特点，是目前较为理想的家蚕不育品系。但镇江野败同时存在以下几个问题：

1)镇江野败雄性不育品系是通过野桑蚕与家蚕远缘杂交育种获得，这在其他鳞翅目害虫中难以操作，以小菜蛾、小地老虎为例，目前还没有发现该种害虫在种群间有像家蚕与野桑蚕之间如此大的差异。

2)镇江野败雄性不育品系需要不断传代，饲养工作巨大，若中途断代，重新获得相同的雄性不育品系十分困难，可重复性差。

3)镇江野败雄性不育品系的不育机制复杂，表现出多种不用的突变表型，且在遗传学上无法与基因相对应，使得希望通过遗传学手段在其他鳞翅目害虫得到相类似不育品系十分困难。