[发明专利]一种制备雌雄均高度不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物

权利要求书

1.一种制备雌雄高度不育的鳞翅目昆虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建Vasa基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Vasa基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Vasa基因靶点和polyA；

所述的第一Vasa基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的第二Vasa基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

2)将步骤1)所述的Vasa基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代；

所述的Vasa基因敲除核酸构建物还包括第一筛选标记基因表达盒，所述的第一筛选标记基因是红色荧光蛋白基因；

和

3)将步骤2)所述的G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配，获得的G2代，即得雌雄高度不育的鳞翅目昆虫；所述的鳞翅目昆虫是家蚕。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫含有Cas9基因表达盒，所述的Cas9基因表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：Nos启动子，Cas9蛋白编码序列和SV40终止子。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫还包括第二筛选标记基因表达盒。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的共转是将所述Vasa基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒混合后所得的混合液显微注射新鲜昆虫卵。

5.一种Vasa基因敲除核酸构建物，其特征在于，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Vasa基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Vasa基因靶点和polyA；所述的第一Vasa基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的第二Vasa基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.一种防治鳞翅目害虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的方法制备而得的雌雄高度不育的鳞翅目昆虫野外放生，通过与野生鳞翅目昆虫交配，使后代减少，降低种群数量；所述的鳞翅目昆虫是家蚕。