[发明专利]一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。

2.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液通过如下方法制得：

抗体纯化、定量后，在0.01mol/L、pH＝9.0～9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，至浓度为5mg/mL；

配置5mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；

向所述辣根过氧化物酶水溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO₄，室温避光搅拌20min，得到氧化后的酶液；

将所述氧化后的酶液在1mmol/L、pH＝4.4、4℃的醋酸盐缓冲液透析过夜，换液3次；

取出透析袋中的溶液，加入0.2mol/LNa₂CO₃缓冲溶液，调至pH＝9.0-9.5，并迅速与纯化、定量后的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；

加入6mg/mL NaBH₄溶液100ul，混匀，4℃反应2h；

还原后的反应体系，于0.15mol/L、pH＝7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；

加入BSA使终浓度为2～3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存。

3.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述标准品为S100B抗原。

4.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液的溶剂为20mmol/L、pH＝6.0的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度如下：0.2％的明胶、0.2％的酪蛋白、150mmol/L的NaCl、0.01％的吐温-20、5％的蔗糖、0.5/万的溴钾酚紫以及0.1％的防腐剂。

5.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的溶剂为水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度为116g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、11.84g/LNaH₂PO₄·2H₂O、180g/L NaCl、5mL/L吐温20以及1mL/L防腐剂。

6.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述发光液A的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液A中的浓度为3mg/mL的鲁米诺、0.25mg/mL的对碘苯酚以及0.5mg/mL的四苯硼钠。

7.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述发光液B的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液B中的浓度为0.5mg/mL的过氧化脲。

8.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液的溶剂为20mmol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述标准品稀释液中的浓度为质量百分含量1％的酪蛋白、质量百分含量8％的海藻糖、质量百分含量3％的甘露醇、1mmol/L的EDTA，质量百分含量0.5％的甘氨酸、150mmol/L的NaCl以及质量百分含量0.1％的防腐剂。

9.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体稀释液的溶剂是20mmol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的浓度为质量百分含量2％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.1％的酪蛋白、150mmol/L的NaCl、质量百分含量0.01％的吐温20、质量百分含量5/1万的氨基比啉、质量百分含量1/20万的染料以及质量百分含量0.1％的防腐剂。

10.一种如权利要求1-9任一权利要求所述的S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配制如下溶液：

用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液与检测抗体稀释液的比例为1:10000；

用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体与检测抗体稀释液的体积比为1:5000，得到酶结合物；

用标准品稀释液溶解标准品，得到多个浓度梯度变化的标准品溶液；

将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照1:20的体积比稀释得到洗涤液。

(2)绘制标准曲线：

在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入校准品溶液50μL，然后每孔分别加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；

用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；

每孔加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；

用空白孔调零点后，使用发光仪测定各孔光密度值；

使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理，以各校准品的光密度值的对数为纵坐标，各校准品的浓度的对数为横坐标作图，得到标准曲线；

(3)待测样品检测

在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入待测样品50μL，然后加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；

用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；

加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；

用空白孔调零点后，使用发光仪测定光密度值；

将待测样本溶液的光密度值代入标准曲线，得到待测样本溶液中S100B的含量。