[发明专利]一种提高L-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体

说明书

本发明公开了一种提高L‑缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体，属于代谢工程领域。本发明通过定点突变的方法，将乙酰羟酸合酶第二底物结合位点附近侧链残基较短的丙氨酸突变成侧链残基长的缬氨酸，改变了乙酰羟酸合酶与底物结合的空间位阻，提高了低pH下，乙酰羟酸合酶的酶活，并在L‑缬氨酸合成的过程中，提高了L‑缬氨酸的产量。用改造后的酶在生成L‑缬氨酸中，可以提高生产效率，减少杂酸。

技术领域

本发明涉及一种提高L-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体，属于代谢工程领域。

背景技术

乙酰羟酸合酶(Acetohydroxyacid synthase,AHAS)是催化支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸)生物合成途径中的第一个关键性的酶。它是一种焦磷酸硫胺素(Thiamindiphosphate,TPP)依赖酶，在TPP和金属离子和黄素腺嘌呤二核苷酸的辅助作用下，即可以催化两分子的丙酮酸缩合形成乙酰乳酸，即L-缬氨酸和L-亮氨酸的前体，又可以催化一分子的丙酮酸和一分子的2-酮丁酸催化形成2-乙酰-2-羟基丁酸，即使代谢途径走向合成L-异亮氨酸。L-缬氨酸是人体必需氨基酸之一，是合成一种免疫抗生素的重要中间体，在食品，医药等方面有广泛的应用。

乙酰羟酸合酶在自然界中广泛存在，迄今为止研究较多的是大肠杆菌中的三种同工酶AHAS I,II,III，但在谷氨酸棒状杆菌中，只存在一个AHAS。AHAS对第一底物丙酮酸的特异性较高，但对第二底物的选择性较差。因此为了高效专一的合成L-缬氨酸，乙酰羟酸合酶对底物的特异性结合就有着非常重要的意义。

由于L-缬氨酸合成的工业方法中，直接提取法的成本较高，化学合成法的反应条件多变，副产物多，成本也高，所以目前微生物发酵法是目前世界上L-缬氨酸工业化生产的方法。利用基因工程技术将乙酰羟酸合酶克隆到谷氨酸棒状杆菌中，获得了乙酰羟酸合酶的高效表达，利用基因工程菌株提高L-缬氨酸的合成，已成为非常重要的代谢工程改造手段。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种乙酰羟酸合酶突变体，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述乙酰羟酸合酶突变体的基因，

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述乙酰羟酸合酶突变体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括细菌细胞或真菌细胞。

本发明的第五个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌，表达SEQ ID NO.1所示的乙酰羟酸合酶突变体。

在本发明的实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌以C.glutamicum ATCC14067为宿主，以pJYW-4为表达载体。

本发明的第六个目的是提供一种提高乙酰羟酸合酶突变体底物亲和力的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示乙酰羟酸合酶的第138位丙氨酸突变为缬氨酸。

本发明的第七个目的是提供一种产L-缬氨酸的方法，以所述谷氨酸棒杆菌为发酵菌株发酵生产L-缬氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将所述谷氨酸棒杆菌在28～30℃发酵72～108h。

本发明还要求保护所述乙酰羟酸合酶突变体及所述谷氨酸棒杆菌在生产L-缬氨酸或含有L-缬氨酸的产品方面的应用。