[发明专利]一种基于碱基编辑的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明属于免疫治疗领域，公开了一种基于碱基编辑的通用型CAR‑T细胞及其制备方法，以及该通用型CAR‑T细胞在制备肿瘤细胞治疗药物中的应用。本发明采用BE‑Plus系统敲除异体T细胞上的TRAC基因和B2M基因，优化了制备通用型CAR‑T细胞的技术方案，所得的CAR‑T细胞不产生宿主排斥反应，可以实现通用型CAR‑T细胞的异体回输。

技术领域

本发明属于免疫细胞制备及免疫治疗领域，更具体的说涉及一种利用碱基编辑系统敲除TRAC和B2M双基因的通用型CAR-T细胞的制备方法及其应用。

背景技术

肿瘤一直以来都是困扰全世界的重大疾病，传统治疗方式包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，这几种方法都有各自的局限。肿瘤免疫治疗是继手术、放疗、化疗后的新的治疗手段，尤其是免疫检查点单抗治疗与CAR-T细胞免疫治疗的崛起，免疫治疗的疗效逐渐获得肯定。2013年，《Science》杂志将肿瘤免疫治疗评选为年度十大科学突破之首。2016年1月，美国基于免疫治疗与靶向治疗发展，提出癌症“登月计划”。

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）：CAR-T细胞治疗是利用基因工程技术将受试者T淋巴细胞体外转染嵌合受体CAR，形成对特定抗原有特异性识别能力的效应T细胞，经过体外扩增后回输到受试者体内，回输的CAR-T细胞通过高效特异的非MHC限制性方式识别特定的肿瘤细胞表面抗原，并对肿瘤细胞完成杀伤。2017年，FDA批准了靶向CD19的基于4-1BB的二代CAR-T产品上市。然而，CAR-T细胞在治疗肿瘤方面也有一些缺点：一是引起细胞因子风暴等副作用；二是目前过继细胞治疗还是基于自体细胞的回输疗法，需要抽取病人一定量的外周血，之后在体外对T淋巴细胞进行修饰改造以及体外扩增，修饰好的自体T细胞增殖到一定数目再回输回病人体内，但是大部分病人尤其是肿瘤病人在进行CAR-T细胞治疗前，经过了放化疗等，免疫系统已经遭到破坏，其自身的T细胞数量、活性及增殖能力有所衰减，这些障碍限制了自体外周血单核细胞的使用，影响了CAR-T细胞治疗和肿瘤临床治疗的应用和发展。因此，针对范围更广，成本更低的通用型CAR-T细胞疗法的出现变得极为迫切。

有研究者把目光转向同种异体嵌合抗原受体细胞的回输，利用健康人外周血分离的T淋巴细胞进行同种异体细胞治疗，优势在于健康人的T细胞较多，活力和功能均优于肿瘤病人自体的T淋巴细胞。但也存在诸多障碍：一方面，供体CAR-T细胞进入受体病人体内，会产生强的移植物抗宿主反应（GVHD），同时，作为异体细胞受体体内也可能会存在宿主抗移植物反应（HVGR）。另一方面，应用免疫抑制类药物抑制受体免疫系统活性，可以排除HVGR，但同时又会影响CAR-T细胞的回输疗效；通过HLA配型预防GVHD，但HLA配型成功难度大，且耗时耗财。

中国专利201710983276.X公开了采取多基因敲除的方法同时抑制了T细胞抗原受体（TCR）和主要组织相容性复合体（MHCI，MHCII），制作通用型的CAR-T细胞的方法。T细胞受体（T cell receptor， TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子，外周血中主要为TCRα/β T细胞，是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。人类白细胞抗原（HLAs）是免疫细胞表面的一种蛋白，也被称为“移植抗原”，如果HLA不匹配，移植排斥的发生率就会非常高。HLA Ⅰ类基因几乎分布于身体全部细胞表面，是一个异二聚体，由重链（α链）与β2微球蛋白组成（B2M）。然而目前公开的技术方案是分为两步制备细胞：首先在T细胞活化24h后先进行CAR感染制备CAR-T细胞，随后再进行电转带有敲除目的基因的sgRNA的CRISPR/Cas9载体，最终成功构建通用型CAR-T细胞。该方法制备过程复杂，加上CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患，