[发明专利]一种基于碱基编辑的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种通用型CAR-T细胞，其特征在于，TRAC和B2M双基因敲除且表达靶向特定抗原的嵌合抗原受体的T细胞，采用的基因敲除是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

2.如权利要求1所述的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述的基因敲除通过BE-Plus系统来实现，具体为：选定基因敲除的位点，设计靶点序列sgRNA，随后筛选出靶点序列，具体如下所示：

TRAC-sgRNA-F：如SEQ ID NO.1所示；

TRAC-sgRNA-R：如SEQ ID NO.2所示；

B2M-sgRNA-F：如SEQ ID NO.3所示；

B2M-sgRNA-R：如SEQ ID NO.4所示；

所述的靶点序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体 、腺相关病毒载体或其他类型的载体上。

3.如权利要求1或2所述的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体识别抗原CD19，CD133，EGFRVⅢ，BCMA，CEA，CD20，Her2，MUC1，MSLN，LewisY，GPC3，c-met中的一种。

4.如权利要求3所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从供者提供的外周血中分离PBMC，并从PBMC中分选出CD3阳性T细胞；

（2）利用转染系统，将表达嵌合抗原受体的质粒、转座酶质粒、BE-Plus双质粒、靶向TRAC的sgRNA质粒和靶向B2M的sgRNA质粒共转染步骤（1）所得的CD3阳性T细胞；

（3）将转染后的细胞进行体外扩增培养，利用分选方法分选出TRAC与B2M双基因敲除的CAR-T细胞，收集并对其进行检测。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述表达嵌合抗原受体的质粒为scFv-CAR转座子质粒，优选采用PiggyBac-transposon睡美人转座子系统，载体上依次串联启动子、信号肽、胞膜外抗原结合区scFv序列、c-myc表位标记、铰链区、嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244, 2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述启动子为人EF1α启动子，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域为CD28-4-1BB，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，铰链区为CD8 Hinge嵌合受体铰链，跨膜区为CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其步骤（2）中所述的靶向TRAC的sgRNA质粒是通过将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的靶点序列退火获得的互补寡核苷酸双链片段导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得；所述的靶向B2M的sgRNA质粒是通过将SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的靶点序列退火获得的互补寡核苷酸双链片段导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其步骤（2）中转染的方法优选电转转染方式，将构建好的多个质粒利用电转的方式转染入目标细胞中。