[发明专利]一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法，所述巢式PCR引物是通过编码猪圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因部分更保守的碱基序列，设计两对巢式检测引物。所述检测方法为：提取待测样品DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两轮PCR扩增，每轮PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测圆环病毒3型ORF2基因的特异性片段。该方法克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，而且成本较低，检测周期短，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法。

技术背景

圆环病毒(PCV)属圆环病毒科圆环病毒属，该病毒为单股环状DNA病毒，无囊膜，其粒子直径为14-17nm，基因组大小约为1.76kd。PCV根据血清型分为PCV1,PCV2和PCV3。其中，PCV1在猪群中广泛存在，但无致病性。PCV2主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征。2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3，PCV3)。PCV3于2016年首次在美国报道，与母猪丘疹性皮炎、肾病综合征和流产相关。PCV3基因组2000bp，与PCV1/2同源性低于40％，遗传进化分析位于不同的分支。PCV3基因组包括3个开放阅读框：其中ORF1编码Rep蛋白；ORF2编码Cap蛋白；ORF3编码一个231个氨基酸的蛋白，功能未知。华南农业大学何启盖教授课题组首次在中国检测到PCV3 China/GD2016株，该毒株与美国PCV3毒株同源性为97.4％-98.5％。PCV3基因组和衣壳蛋白核苷酸序列在中国毒株之间相似性分别为99.0％-100％和98.4-100％；PCV3基因组和衣壳蛋白核苷酸序列与美国毒株的相似性分别为99.0％-99.1％和98.4％-98.9％。进一步的调查研究表明我国的新型PCV3毒株和蝙蝠圆环病毒毒株BtMr-CV/GD2012(KJ641711.1)存在重组现象，表明新型猪PCV3毒株和蝙蝠PCV毒株之间存在遗传进化关联性。

PCV3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，生产性能下降；妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡；不同胎龄胎儿均可发生流产。

目前针对PCV3的研究尚处于起步阶段，需尽快开展相关检测技术研究，建立PCV3快速、灵敏、特异的病原学和血清学检测方法，鉴于PCV2与PCV3存在交叉免疫保护可能性较低，应加快PCV3毒株的分离与鉴定，为开展疫苗研制及动物回归试验工作奠定基础，保障我国生猪产业健康发展。普通PCR方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。但普通PCR诊断存在灵敏度较低这样的问题，且PCV3亚临床感染猪群中病毒含量很低，普通PCR灵敏度较差，易造成漏检。

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两轮PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且两轮PCR引物发生非特异性结合的概率极低。当前圆环病毒3型PCV3检测的靶标多为ORF2，保守性很高，为PCV3复制必需的一种结构蛋白，因此，编码Cap结构蛋白的ORF2基因序列可作为检测PCV3的诊断靶标。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种快速简便的巢式PCR检测猪圆环病毒3型(PCV3)的方法。

为了实现本发明的目的，本发明是技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种用于检测猪圆环病毒3型的巢氏PCR引物。

通过编码猪圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因部分更保守的碱基序列，以此为基础，设计两对巢式检测引物，所述两对检测引物，分别为外侧引物PCV3-O-F、PCV3-O-R和内侧引物PCV3-I-F、PCV3-I-R，其序列如下：