[发明专利]一种重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白及其制备方法和应用，包括非洲猪瘟病毒表面囊膜蛋白的胞外区和胞内区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制备方法如下：1)将密码子优化后的SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到真核表达载体中；2)再将含有非洲猪瘟病毒亚单位蛋白编码基因的重组表达载体转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述CHO细胞株，得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后，得到非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白。5)将CD2V蛋白和药学上可以接受的佐剂混合得到亚单位疫苗。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟表面CD2V亚单位蛋白且制备方法简单、成本低、制备的疫苗能够达到国家现有标准。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种非洲猪瘟CD2V蛋白制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。猪感染非洲猪瘟病毒后出现皮肤充血，内脏器官出血，高热为特征临床症状，猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高，对畜牧业影响巨大。世界动物卫生组织将其列为A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。

非洲猪瘟自1927年在非洲大陆发现以来，对非洲和欧洲的养猪业造成极大打击。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经济损失。虽然，国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而弱毒苗保护效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。CD2V蛋白由EP402R基因编码，有一段信号肽和跨膜区域。胞外区的氨基酸残基与宿主的CD2蛋白相似，包含2个免疫球蛋白样结构域，能吸附红细胞在病毒扩散及损伤淋巴细胞的过程中起着重要的作用。研究发现，CD2V是病毒囊膜表面蛋白，针对CD2V的抗体可以很好的阻止病毒的吸附。因此，CD2V是一个很好的保护性抗原。在Ruiz-Gonzalvo,F.,Rodriguez,F.and Escribano,J.M.,Virology 218,285-289(1996),报道用杆状病毒系统表达CD2V胞外区，并且只有western的结果，没有SDS-PAGE，表达量很低。但未见其大量表达，说明CD2V胞外区的稳定性较差，因此，很难在实际生产中应用。在当前没有可能大规模制备灭活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种能够预防该疾病的疫苗或具有能够预防该疾病的亚单位蛋白具有重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题：一是提供一种可大规模工业化生产的重组的非洲猪瘟表面CD2V亚单位蛋白及其制备方法和应用；

为了解决该问题，本发明人在充分分析、研究目前所能得到的非洲猪瘟病毒的资料的基础上，并通过结构分析CD2V蛋白的整体结构，创造性的提出CD2V蛋白跨膜区的存在，影响了规模化生产，为了一种得到具有良好免疫原性且稳定的CD2V亚单位重组蛋白，将CD2V蛋白的跨膜区除去，得到重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白，所述重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白包括非洲猪瘟病毒表面囊膜蛋白的胞外区和胞内区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

为了能够产业化生产该亚单位蛋白，本发明人在充分分析、研究该亚单位蛋白的原始基因编码序列的基础上，提出了密码子优化后的能够在CHO细胞中高效分泌表达该亚单位蛋白的基因序列，所述密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示。