[发明专利]一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用

说明书

本发明公开了一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一株基于前导肽工程和多位点饱和突变构建的重组角蛋白酶及前导肽工程改造的方法。重组菌株M7表现出高角蛋白酶催化潜力，酶活从179U/mL显著改善至1114U/mL，最适反应温度为40℃，最适反应pH为10.0，在40℃水浴90min后仍保留超过80％的酶活，热稳定性较好，适合于工业化大规模生产。并且利用前导肽工程改造蛋白酶的方法可以成为修饰具有自剪切特性的工业酶的通用途径。

技术领域

本发明涉及一种催化性能提高的角蛋白酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白质，是一种硬性纤维蛋白，含有较多氢键和二硫键，其三维结构具有高度稳定性，加上疏水作用，其难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等有效降解。角蛋白中蛋白质营养丰富，羽毛中蛋白占80％，羊毛中能占到99％，并且其含有多种动物所需要的必须氨基酸，这些都有很高的应用价值，但这些蛋白资源却被大量浪费，同时还对环境造成了污染，所以角蛋白的回收与利用受到人们越来越多的重视。

角蛋白酶具有专一的降解天然角蛋白的功能，是一种有着强生物活性的蛋白酶。大多属于胞外的丝氨酸蛋白酶类，少部分属于结合酶或胞内蛋白酶。目前文献报道的产角蛋白酶微生物主要来源于细菌、真菌或放线菌，这些微生物大多从羽毛，鸟类羽毛或毛发废弃物堆积处分离获得。角蛋白酶相比于其他蛋白酶可以更温和、高效地处理含有角蛋白的原料，同时其可以改善处理后的角蛋白的营养价值。目前，角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织、制革等工业中，在生物制剂的制备、废弃生物资源的利用等方面具有重要的应用价值，因此关于角蛋白酶的研究备受关注。

据报道，国内角蛋白酶的研究多处于对菌株的分离、筛选、角蛋白酶的分离纯化以及理化性质的研究阶段。近年来，角蛋白酶基因的挖掘和生产受到越来越多的关注。然而，能够有效表达高活性的角蛋白酶的潜在菌株仍然很少，角蛋白酶产生菌普遍存在产酶水平偏低、生产成本较高的问题，这将成为角蛋白酶工业化生产及应用的主要障碍。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明结合前导肽工程和多位点饱和突变的方法对短小芽孢杆菌角蛋白酶分子进行改造，构建出一种重组角蛋白酶工程菌株，同时也提供了一种有效的前导肽工程改造策略。

本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，以氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸、前导肽区域第42位点的丝氨酸、54位点的天冬酰胺、62位点的异亮氨酸、91位点的谷氨酸、95位点的丝氨酸中至少一处突变为其他的氨基酸。

进一步地，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸。

进一步地，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及将前导肽区域第42位点的丝氨酸突变为天冬氨酸、54位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、62位点的异亮氨酸突变为谷氨酸、91位点的谷氨酸突变为天冬酰胺、95位点的丝氨酸突变为谷氨酸。

进一步地，将亲本角蛋白酶前导肽切割位点P1的酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及将前导肽区域第42位点的丝氨酸突变为天冬氨酸、54位点的天冬酰胺突变为丙氨酸、62位点的异亮氨酸突变为赖氨酸、95位点的丝氨酸突变为天冬氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述角蛋白酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述角蛋白酶突变体的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。

本发明的第五个目的是提供所述的角蛋白酶突变体在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。