[发明专利]产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒

说明书

本发明公开了产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明提供了用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增的成套反应引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB组成；所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB对应的核酸序列分别为序列表中的序列1至序列6。本发明引物可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测产酸克雷伯杆菌，不需要复杂仪器，为产酸克雷伯杆菌的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和疾病预防控制中心筛查和检测产酸克雷伯杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术

克雷伯杆菌是社区感染和医院感染重要的病原菌，尤其在免疫缺陷患者和ICU重症患者可以引起严重的肺部感染和血流感染，具有很高的发病率和死亡率。克雷伯杆菌属主要包括肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、解鸟氨酸克雷伯杆菌、植生克雷伯杆菌和土生克雷伯杆菌5个菌种，其中肺炎克雷伯杆菌和产酸克雷伯杆菌是引起人肺部感染和血流感染的重要病原体。除了引起肺部感染和血流感染，产酸克雷伯杆菌也是食物中毒和抗生素相关出血性结肠炎的重要病原体。新英格兰杂志有研究证明产酸克雷伯杆菌是非难辨梭菌导致的抗生素相关出血性结肠炎的主要病原菌。产酸克雷伯杆菌可以分泌细胞毒素，具有很强的毒力和很高的致病性，有研究证实在小鼠腹腔注射产酸克雷伯杆菌后，实验小鼠在24h全部因感染死亡。传统的产酸克雷伯杆菌的检测方法，包括乳酸菌降解分析实验、松三糖利用实验、API鉴定法以及VITEK2细菌自动鉴定法等，通常基于表型检测，因此很难将产酸克雷伯杆菌同肺炎克雷伯杆菌等其他克雷伯杆菌属的细菌相鉴别。目前常用的分子基因分型方法,如脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性DNA分析和扩增片段长度多态性分析等，对实验设备及操作人员具有很高的要求，不适于基层医疗机构推广。因此,目前亟需建立一种快速、简便、经济、高效、特异的产酸克雷伯杆菌检测方法。

环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种新型恒温DNA快速扩增技术，在Bst DNA聚合酶作用下，65℃恒温实现对靶基因序列的高效、快速、特异性特的扩增。较于传统的PCR技术，LAMP对实验设备要求低，只需要一个普通水浴锅即能满足要求，而且加入显色剂后，反应结果肉眼可见，可以用于感染性疾病的快速诊断以及细菌、病毒和寄生虫等感染病原体的流行病学监测。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增的成套反应引物。

本发明提供的成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LoopF和引物LoopB组成；

所述引物F3为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物B3为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物FIP为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物BIP为如下(a7)或(a8)：