[发明专利]一种甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制备2-α-甘油葡萄糖苷中的应用

说明书

本发明公开了一种甘油‑2‑α‑葡萄糖基化酶在制备2‑α‑甘油葡萄糖苷中的应用，所述甘油‑2‑α‑葡萄糖基化酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；本发明所述生产2‑α‑GG的重组大肠杆菌，即重组大肠杆菌(Escherichia coli)IEF‑bpmsp208能够在胞内高效合成蔗糖磷酸化酶，以甘油和蔗糖为底物，高效催化甘油的糖基化反应，反应18‑24小时，可得到大于10％的2‑α‑GG溶液，且对底物蔗糖的转化率大于92％，2‑α‑GG的产物浓度高，转化率高，有利于2‑α‑GG分离纯化。

(一)技术领域

本发明涉及一种含甘油-2-α-葡萄糖基化酶在生产2-α-甘油葡萄糖苷(2-O-α-D-glucosylglycerol，以下简称2-α-GG)中的应用。

(二)背景技术

2-α-甘油葡萄糖苷(2-α-GG)是一类由甘油分子与葡萄糖分子以糖苷键结合的物质，结构式如图1所示，其通过糖苷键将一个D-吡喃葡萄糖和甘油2号位的羟基偶联，是自然界多种植物、藻类和细菌对抗干旱和高盐环境的天然保护剂。葡萄糖分子的构型结合甘油分子的位置分为多种，目前已经鉴定出六种，但作为天然渗透压抵抗分子的是2-α-GG。它是微生物在胁迫条件下合成的一种渗透保护物质，同时还是一种大分子稳定剂，能够在高温或冷冻干燥条件下稳定蛋白质或酶等生物大分子结构，也可用于蛋白质药物等的长期保存；由于具有低吸水性、高保湿性的特点，用于提高皮肤保湿效果，是一种良好的化妆品添加剂，抗氧化和抗衰老等功效。更有研究发现2-α-GG还具有治疗过敏性呼吸系统疾病等多种人体保健功效。

2-α-GG在化妆品、医药等行业具有广泛的应用前景，但局限于2-α-GG的生产技术，高纯度的产品价格高居不下。目前的生产方法包括化学法合成、酶法合成和植物或藻类中直接提取。其中化学法缺乏立体和区域专一性，产物多样，得率低；许多酶法转化的产物亦含有多个糖基化位点的产物，难以得到单一产品2-α-GG；直接提取的方法，其得率太低，成本高，难以产业化。目前，2-α-GG的生产技术侧重于筛选专一性更好的酶法转化和微生物代谢工程直接发酵生产。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制备2-α-GG中应用，实现了用酶法高效、专一性的生产2-α-GG。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制备2-α-甘油葡萄糖苷(2-α-GG)中的应用，所述甘油-2-α-葡萄糖基化酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。所述甘油-2-α-葡萄糖基化酶来源于Leuconostocpseudomesenteroides。

本发明所述甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制备2-α-甘油葡萄糖苷(2-α-GG)中的应用方法为：将含甘油-2-α-葡萄糖基化酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液或发酵离心的湿菌体用缓冲液悬浮的菌悬液为催化剂，以甘油为底物，以蔗糖为辅助底物，在30-45℃的条件下进行反应，获得含2-α-甘油葡萄糖苷的反应液，将反应液分离纯化，获得2-α-甘油葡萄糖苷。所述发酵液或菌悬液中湿菌体含量为5-100g/L(优选30-50g/L)，甘油的终浓度为100-150g/L(优选120-140g/L)，蔗糖终浓度为300-400g/L(优选330-350g/L)。

进一步，所述反应pH为6.0-8.0，反应时间为24h。

进一步，所述缓冲液为pH7.0、2.5mM磷酸缓冲液。

本发明所述重组大肠杆菌构建方法：将SEQ ID NO.1所示甘油-2-α-葡萄糖基化酶基因(lpmsp)克隆到pET28a质粒上，构建pET28a-lpmsp重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-lpmsp)。