[发明专利]近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法

说明书

本发明公开了近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法。所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的酸性蛋白酶的酶活可达176.9U/mL，比酶活达1478.3U/mg，远高于现有的假丝酵母酸性蛋白酶；其水解效果也优于商业木瓜蛋白酶及酸性蛋白酶。本发明还提供了所述酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法，首次在毕赤酵母上成功表达纯化了近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，大幅度提高了SAPP1蛋白酶的产量，产量可高达312.5mg/L发酵液，具有广阔的推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法。

背景技术

假丝酵母菌是世界上8％～10％医院获得性血流感染的致病因子，白假丝酵母是最常见的，但其他物种(如近平滑假丝酵母Candida parapsilosis)的感染频率也在增加。近平滑假丝酵母是拉丁美洲第二最常见的假丝酵母，在1岁以下的儿童中尤其流行。近平滑假丝酵母也是欧洲常见的感染源。近平滑假丝酵母的发病机制与使用留置医疗器械和高糖饲料有关，已经成为败血症和免疫受损患者伤口和组织感染的一个重要原因。这一物种经常被发现存在于医护人员手中，并且已经导致了几起暴发感染。

与白色假丝酵母菌和热带假丝酵母菌不同，近平滑假丝酵母不是一种专性的人类病原体，它是从非人类来源如家畜、昆虫或土壤中分离出来的。近平滑假丝酵母也是一种正常的人类共生菌，是最常分离的真菌之一。免疫功能低下的个体和外科手术患者，尤其是那些胃肠道手术的患者，感染近平滑假丝酵母的风险很高。目前对于治疗由C.parapsilosis引起的侵袭性念珠菌病尚无共识，对其感染机制也没有非常清晰的研究，通常认为其分泌的酸性蛋白酶在破坏宿主角质层、水解基质和蛋白质中起重要作用。目前的研究中主要集中在白色假丝酵母上，对近平滑假丝酵母的研究极少，重组表达并纯化假丝酵母分泌酸性蛋白酶几乎没有，其酸性蛋白酶的表达纯化对研究假丝酵母感染机制及寻找潜在治疗方法具有重要意义。

另一方面，近平滑假丝酵母也是一种重要的工程菌。魏文婷等利用近平滑假丝酵母作为生产甘露醇的工程菌；谢鑫磊等利用近平滑假丝酵母作为生产油脂的工程菌；李亚莉等以晒青茶为原料，接种近平滑假丝酵母发酵普洱茶生产GABA；许敏伟利用近平滑假丝酵母作为立体异构生产(S)-PED的反应介质。近平滑假丝酵母来源的酸性蛋白酶在营养和致病方面都有重要功能，而且在酸性条件下具有高活性和高稳定性的蛋白酶，具有重大的工业应用前景。目前重组表达假丝酵母酸性蛋白酶的产量较低，如Zuzana Vinterová等在酿酒酵母里表达近平滑假丝酵母SAPP1的产量为3mg/L；E.Hochuli等在大肠杆菌表达SAP2的酶活为2.3U/mg；Jing Li等在大肠杆菌表达SAP6的酶活为19.6U/mg。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，该酸性蛋白酶属于A1家族，发酵液蛋白酶活为176.9U/mL，比酶活为1478.3U/mg，高于同类报道的酸性蛋白酶酶活。

本发明的另一目的在于提供所述的酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法。本发明以近平滑假丝酵母为来源，采用了基因工程的技术方法，从中获得酸性蛋白酶基因SAPP1，构建重组质粒，然后在毕赤酵母中重组表达，通过亲和层析对发酵液中的酸性蛋白酶组分进行纯化，首次在毕赤酵母中成功表达纯化了近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1。

本发明的再一目的在于提供一种重组表达载体、重组工程细胞。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。