[发明专利]近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法

权利要求书

1.一种近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，其特征在于：

其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，其特征在于：

编码所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建含有所述的酸性蛋白酶基因片段SAPP1的重组表达载体；

(2)将所述的重组表达载体转化细胞；

(3)对阳性细胞进行发酵诱导及纯化。

4.根据权利要求3所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的表达载体为表达载体pICh，该表达载体通过将表达载体pPIC9K启动子改造为dl+2x201 AOXl，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；优化α-factor信号肽编码序列如SEQ ID No.6所示，去除载体pPIC9K当中3个Pst I和1个Xho I，突变Amp抗性基因7068T>G，删除了Kan抗性片段，并将多酶切位点改造替换为EcoR I,BamH I,Mlu I,Xho I,Pst I,Apa I得到。

5.根据权利要求3所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于：

所述的酸性蛋白酶基因片段SAPP1与表达载体pICh片段按摩尔比为1：5进行连接；

所述的近平滑假丝酵母为近平滑假丝酵母GIM2.146；

步骤(2)中所述的转化为将所述的重组表达载体线性化后通过电转化法转入细胞。

6.根据权利要求5所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的细胞为毕赤酵母GS115；

所述的线性化的操作为用Sal I内切酶酶切所述的重组表达载体。

7.根据权利要求3所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述的将所述的重组表达载体转化细胞的具体步骤为：

①构建并提取pMD18-T-SAPP1克隆载体质粒，以之为模板进行PCR扩增，鉴定产物后用纯化回收，得到回收产物；

②把表达载体pPIC9K启动子改造为dl+2x201AOXl，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；优化α-factor信号肽编码序列如SEQ ID No.6所示，去除载体pPIC9K当中3个Pst I和1个Xho I，突变Amp抗性基因7068T>G，删除了Kan抗性片段，并将多酶切位点改造替换为EcoRI,BamH I,Mlu I,Xho I,Pst I,Apa I，构建得到表达载体pICh；

③使用BamH I和Pst I对步骤①的回收产物和步骤②得到的pICh载体进行双酶切后，分别纯化回收，得到双酶切后的蛋白酶基因片段和pICh载体；

④将步骤③中得到的蛋白酶基因片段和pICh载体进行体外连接，构建得到表达质粒pICh-SAPP1；

⑤对表达质粒pICh-SAPP1，用Sal I内切酶酶切，将表达质粒载体线性化；

⑥制备毕赤酵母GS115感受态；使用电转化法把步骤⑤得到的线性化质粒转入毕赤酵母中。