[发明专利]一种小型鱼类DNA无损伤提取方法及DNA提取液

说明书

本发明公开一种小型鱼类DNA无损伤提取方法及DNA提取液，该提取方法包括：1）用棉签从鱼体一侧的腮盖后缘向尾部刮取鱼体表粘液；2）将棉签浸没于DNA提取液中，涡旋、静置；3）将棉签拧干，加入异丙醇，混匀后‑80℃过夜处理或以液氮处理10min；4）样品自然解冻，离心，弃上清，加入乙醇，再次离心，取沉淀干燥，即提取获得基因组DNA；所述DNA提取液包括：20mL 1M Tris、5mL 0.5M EDTA、12.5mL 2M NaCl、57.5mL ddH₂O、5mL质量分数为10%的SDS；本发明可应用于小型鱼类DNA的无损伤提取，操作简便，检测准确性高，对鱼类产生的应激反应低，宜于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种基因组DNA提取方法，特别是一种小型鱼类DNA无损伤提取方法及DNA提取液。

背景技术

随着环境污染的日趋严重，造成鱼类的生存空间和繁殖都遇到了巨大的问题，对鱼类种植资源的遗传选育已提上日程。对鱼类进行人工遗传选育是保持鱼类种质资源的重要手段和途径，分子遗传育种通常要涉及到到鱼类的非致命性取样，目前通常采用麻醉剪尾鳍的方法。这种方法对鱼类虽然不损害鱼的生命，但是对鱼类还是会造成一定的伤害，不利于鱼类的生存。

鳑鲏是杂食性鱼类，栖息在缓慢流动或静止的水域，依靠淡水河蚌（无齿蚌属：Anodonta）繁殖，活动范围小，寿命短。广泛分布于东亚、东南亚和欧洲。鳑鲏类鱼有着极高的观赏价值和药用价值，因此被许多鱼类饲养爱好者和医药学家的青睐。但随着环境栖息地的破坏，对其种质资源的保护已提上日程。

文献“一种鱼类DNA的非损伤检测方法”（宋君等，四川动物，2013）公开了一种利用鲫鱼体表粘液提取基因组DNA的方法，但该方法仅适用于体表粘液丰富的大型鱼类，其采用任何工具都可以提取到体表粘液；中国专利申请201310122540.2公开了一种从大鲵体表粘液中提取基因组DNA的方法、中国专利申请201510956095.9则公开了一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法，然而这两篇专利所适用的对象范围均有其特殊性，大鲵身上的鳞片已经退化，直接暴露在外的皮肤中，有不少特殊的黏液腺，能分泌出大量的黏液，形成一个黏液层；黄鳝属于无鳞鱼类，其粘液腺更发达，因此两者均不存在取样难的问题。

而长度为2-5cm的小型鱼类的体表分泌粘液较少，体表粘液的提取较为困难，并不适用于上述提取方法。而在斑马鱼等小型鱼类模式动物研究中通常采用的剪尾鳍的方法，会对鱼类造成较强的机械刺激和损伤，不利于后期保种及人工繁育。因此，在遗传育种中无损伤提取小型鱼类基因组DNA已成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种DNA提取液及其应用，以实现对小型鱼类的基因组DNA提取，本发明是这样实现的：

一种小型鱼类DNA无损伤提取方法，其具体步骤如下：

1、采集鱼类体表粘液：

（1）双手带上一次性无菌医用橡胶手套，取一个白色瓷盘，并在白色瓷盘上覆盖保鲜膜，然后取鱼放置在保鲜膜上；

（2）取一根棉签，然后一只手的食指和中指分别按住鱼的头部和尾部进行动物保定，另一只手用棉签按着鱼体的侧面刮取粘液；从鱼体的腮盖后缘向尾部刮取5-10次；

（3）步骤（2）粘液刮取完成后，将鱼翻转，按照步骤（2）的方法对鱼体的另一侧刮取粘液；

（4）刮取完成后，将棉签放置在干净的试管中密封保存，并将鱼放回饲养；

2、基因组DNA提取：

（1）将DNA提取液预热至55℃；

（2）在1.5mL离心管中加入400μLDNA提取液，将步骤1获得的棉签剪断长柄，置于提取液中，涡旋10-15s, 室温静置15min;