[发明专利]一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用，涉及生物技术领域，所述MDCK细胞株中Tpl2基因第1外显子第239位～第243位碱基缺失。本发明通过移码突变敲除MDCK细胞株中的Tpl2基因，但该突变对MDCK细胞传代10代后的生长速度和细胞形态无影响；试验表明，本发明提供的Tpl2缺陷型MDCK细胞株可稳定遗传，安全可靠，克服了现有突变MDCK细胞遗传不稳定或不安全的问题。本发明所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株接种流感病毒后可用于提高流感病毒产率，相对于常规MDCK细胞培养的上清血凝效价和上清病毒TCID₅₀滴度均有显著提高，克服了现有MDCK细胞培养流感病毒的产量不足问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

流感病毒(AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属，是一种人兽共患的RNA病毒，其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分别有16种和9种。在世界范围内给养殖业造成了巨大的经济损失，同时给人类健康带来严重的威胁。疫苗接种是预防病毒感染最有效的策略之一。传统流感疫苗通过鸡胚接种的方式生产，在世界范围内已广泛应用，其安全性已得到了公众的认可。但这种技术仍存在一定的局限性，如鸡胚制备周期长，在流感大流行的情况下很难在短时间用鸡胚生产出所需的疫苗，及鸡胚是开放性生产系统，易于污染等。

MDCK细胞是进行流感研究最常用的细胞，也是目前生产流感病毒疫苗的细胞系之一。与传统的鸡胚生产系统相比，临床分离的毒株能在MDCK细胞上生长良好，且MDCK细胞生产的流感灭活疫苗可以诱导产生更高的血凝抑制活性和中和抗体效价(Barrett P N,Mundt W,Kistner O,et al.Vero cell platformin vaccine production:movingtowards cell culture-based viral vaccines[J].Expert Review ofVaccines,2009,8(5):607-618)，同时MDCK细胞生产系统，具有细胞可建库并可进行全面的细胞库检测、在封闭的生物反应器系统生产可减少外源因子污染、疫苗制备周期短等优势。因此利用MDCK细胞生产疫苗可以有效缓解流感季节流感疫苗供应量不足的问题，同时可提高疫苗的免疫原性，减少鸡蛋引起的过敏反应。

细胞的免疫应答可以抑制病毒复制，而使抗原的表达量降低，因此可以通过降低细胞免疫应答的能力来促进病毒的复制。因此Hamamoto等设想，如果利用RNA干扰技术来抑制与干扰素通路有关的功能基因，有可能提高流感疫苗在MDCK细胞中的增殖滴度。作者利用siRNA敲低IRF7(可以调节Ⅰ型干扰素基因和干扰素刺激基因的转录)的表达可以将流感疫苗的产量提高3～4倍，而用shRNA敲低IRF7能够将产量提高2～8倍(Hamamoto I,TakakuH,Tashiro M,et al.High Yield Production of Influenza Virus in Madin DarbyCanine Kidney(MDCK)Cells with Stable Knockdown of IRF7[J].Plos One,2013,8(3):e59892)。刘爱玲等利用miRNA敲低了IFNAR1的表达可以将流感病毒的产量提高4～5倍(LiuA L,Li Y F,Qi W,et al.Comparative analysis of selected innate immune-relatedgenes following infection of immortal DF-1cells with highly pathogenic(H5N1)and low pathogenic(H9N2)avian influenza viruses[J].Virus Genes,2015,50(2):189-199.)。研究报道降低干扰素应答所用的方法是使用RNAi，该技术存在不能完全敲除、脱靶严重等缺陷。

发明内容