[发明专利]一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株，其特征在于，MDCK细胞株中Tpl2基因第1外显子中第239位～第243位碱基缺失。

2.构建权利要求1所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株的方法，包括以下步骤：

(1)将向导引物上下游引物序列单链混合后退火形成双链，得到向导引物双链；

所述向导引物的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)以BbsⅠ酶且pUC19质粒，得到线性化pUC19质粒；.

(3)将线性化pUC19质粒与向导引物双链连接，得到pUC19-sgRNA质粒载体；

(4)以pUC19-sgRNA和pCas9-EGFP共转染MDCK细胞，36～48h后分选表达EGFP的单个细胞进行培养7d，以靶位点鉴定引物筛选碱基数缺失的转染后MDCK细胞，即得Tpl2缺陷型MDCK细胞株；

所述靶位点鉴定引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ IDNO.4所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述退火形成双链的PCR反应程序为：37℃30min，95℃5min，1℃/s的速率降温至25℃。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述连接的反应体系以每10μL总体系计，包括以下试剂：

100ng/μL的线性化pUC19-sgRNA质粒1μL、0.1μM的向导引物双链1μL、T4 DNA连接酶1μL、10x连接酶Buffer 1μL和余量的水。

5.根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述连接的反应温度为4℃，连接的反应时间为10～16h。

6.权利要求1所述Tpl2缺陷型MDCK细胞株或权利要求2～5任意一项所述方法制备得到的Tpl2缺陷型MDCK细胞株在提高流感病毒产率中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为禽流感病毒。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述禽流感病毒为H5N1亚型禽流感病毒。