[发明专利]一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法

权利要求书

1.一种生物活性肽N¹⁴-Desacetoxytubulysin H的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、制备TUV片段(2)；

步骤2、制备生物活性肽N¹⁴-Desacetoxytubulysin H。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的制备TUV片段(2)具体为：

其合成路线为：

包括以下步骤：

步骤1.1、化合物10的合成：

首先按文献(Macromolecules,2012,45(20):8172-8192)制得化合物9；

将化合物9溶于甲醇，加入苯甲醛，加热回流反应4h后，冰水浴冷却到0℃，分批慢加硼氢化钠，然后于室温下搅拌反应12h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩；

加入四氢呋喃/水混合溶剂，同时加入碳酸氢钠，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯，30min后升到室温搅拌反应12h，减压浓缩，加水稀释，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物10；

步骤1.2、化合物11的合成：

将化合物10溶于DMSO，水浴冷却下加入三乙胺和三氧化硫-吡啶复合物，于室温下搅拌反应3h后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用1M的KHSO₄溶液洗，水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干；

加入二氯甲烷，同时加入乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦，于室温下搅拌反应10h后，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物11；

步骤1.3、化合物13的合成：

将化合物11溶于甲醇，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体12；

将上述中间体12溶于无水四氢呋喃，冰水浴冷却下加入硼氢化钠和单质碘，30分钟后将溶液加热回流反应15h，冰水浴冷却到0℃，加甲醇淬灭反应，减压浓缩，将残余物溶于水，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物13；

步骤1.4、化合物14的合成：

将化合物13溶于无水二氯甲烷，加入PCC，于室温下搅拌反应4h后，过滤，滤液减压浓缩，用第一淋洗剂快速柱层析；

加入二甲亚砜，同时加入亚硝基苯和L-脯氨酸，于室温下搅拌反应1h，冰水浴冷却到0℃，加入甲醇和硼氢化钠，搅拌反应30分钟后，加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用第二淋洗剂快速柱层析得到中间体13’；

将上述中间体13’溶于乙醇，加入冰醋酸和锌粉，于室温下搅拌反应5h，加水稀释，冰水浴冷却到0℃，加氢氧化钠固体碱化溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用第三淋洗剂快速柱层析得到化合物14；

步骤1.5、化合物15的合成：将化合物14溶于无水DMF，加入咪唑和4-二甲氨基吡啶，冰水浴冷却到0℃，加入叔丁基二甲基氯硅烷，30分钟后恢复到室温搅拌反应14h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用KHSO₄溶液洗两次，水洗，饱和食盐水洗涤两次，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物15；

步骤1.6、化合物17的合成：将化合物15溶于异丙醇，加入10％钯碳催化剂，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩；

加入无水二氯甲烷，同时加入化合物16，EDCI以及HOBt，搅拌均匀后冷却到0℃，滴加三乙胺，30分钟后恢复到室温搅拌反应20h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物17；

步骤1.7、化合物18的合成：将化合物17溶于无水DMF，冰水浴冷却到0℃，加入60％氢化钠，搅拌反应40分钟后滴加碘甲烷，30分钟后恢复到室温搅拌反应2h，冰水浴冷却到0℃，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物18；

步骤1.8、化合物19的合成：将化合物18溶于无水甲醇，加入氟化铵固体，于室温下搅拌反应6h，然后加饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物19；

步骤1.9、化合物Tuv片段(2)的合成：将化合物19溶于无水乙腈，加入2-碘酰基苯甲酸IBX，加热回流反应1.5h，冷却到室温，过滤，滤液减压浓缩，用第一淋洗剂快速柱层析；

加入无水甲醇，同时加入化合物20和三乙胺，于室温下搅拌反应15h，减压浓缩，然后用第二淋洗剂快速柱层析；

加入无水乙腈，同时加入活性二氧化锰，将溶液加热到60℃搅拌反应20h，然后冷却到室温，滴加DBU，10分钟再滴加三氯溴甲烷，于室温下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩，用淋洗剂快速柱层析得到Tuv片段(2)。