[发明专利]一种VDR基因条件性敲除的floxed小鼠模型构建方法

说明书

本发明属生物技术领域，涉及一种VDR基因条件性敲除的floxed小鼠模型构建方法。该方法利用基因打靶及ES细胞重组技术，利用细菌人工染色体在VDR基因外显子3的两侧分别放入Frt‑neo‑Frt‑loxP、loxP序列，构建VDR‑floxed载体，通过电击导入ES细胞；利用抗药性基因筛选出阳性ES细胞克隆后，经PCR及其产物测序确定，将阳性ES细胞移植至代孕的母鼠体内，产生含ES细胞来源的嵌合体小鼠；雄性嵌合体小鼠与雌性野生型小鼠互交F1代小鼠，经PCR及其产物测序确认获得含有Neo基因的VDR‑floxed杂合子小鼠；再将其与Flp小鼠杂交，获得去除neo基因VDR‑floxed杂合子小鼠。经实验验证本发明构建的VDR‑floxed小鼠模型，能导致VDR基因外显子3区域的敲除，导致VDR表达的缺失。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及动物基因工程和基因遗传修饰的方法，具体涉及一种基于Cre-loxp系统的VDR基因条件性敲除的floxed小鼠模型构建方法。

背景技术

现有技术公开了维生素D是一组脂溶性开环类固醇物质的统称，其主要存在形式有两种：维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆骨化醇)。人体内的维生素D主要来源于皮肤，仅10-20％来源于食物摄入；皮肤中的7-脱氢胆甾醇和8-脱氢胆甾醇在紫外线的照射下转化为维生素D3，维生素D3首先经肝脏25羟化酶作用转化为25-羟维生素D3[25(OH)D3]，再经肾脏近端小管1α羟化酶作用生成具有生物活性的1,25(OH)2D3，又称为活性维生素D。

研究显示，活性维生素D主要通过与细胞内的特异性维生素D受体(vitamin Dreceptor,VDR)结合而发挥生物学效应。VDR属于核受体超家族，当1,25-(OH)2D3与VDR结合后可引起VDR的构象改变和磷酸化，继而与视黄酸X受体(retinoid X receptor，RXR)结合形成异二聚体，该VDR-RXR复合物可与靶基因启动子区域的特异性核苷酸序列——维生素D反应元件(vitamin D-responsive element，VDRE)结合，激活靶基因的转录，该过程即为活性维生素D的基因调控途径。

资料显示，VDR在体内分布非常广泛，表达量较高的部位为肠道(大肠、小肠)、肾脏远端小管、甲状旁腺及成骨细胞，参与体内矿物质代谢；除此之外，胰腺、支气管、胸腺、前列腺、乳腺等组织亦有丰富的表达。研究还证实，VDR在皮肤、免疫系统(单核细胞、淋巴细胞等)、肝脏、中枢神经系统表达。VDR在体内的广泛分布，提示其生物学功能的多样性，活性维生素D-VDR系统除参与调解矿物质和骨代谢外，尚具有调节免疫、抗感染、抑制肿瘤细胞增殖分化等能力，但具体的机制尚不明确。

基因敲除动物是研究某个基因在动物体内功能的最好的动物模型，其构建是利用基因打靶技术和胚胎干细胞(ES细胞)技术。传统的基因敲除动物是将靶基因在动物个体内的完全敲除，使得该基因自胚胎期开始在体内各组织的表达活性丧失，实践表明，该种动物模型可能会导致动物在胚胎早期死亡或后期发育的异常，不利于分析该基因在特定组织内或特定发育时间内的功能，例如，VDR基因敲除纯合子小鼠(VDR-KO)出生后出现低血钙、高PTH，表现为佝偻病、脱发、生殖免疫及神经等系统发育的异常，若断奶后不给予高钙、高维生素D饮食纠正将死亡；另外，由于VDR在多种组织中表达，利用VDR基因全身敲除小鼠研究局部VDR的功能，由于表型的复杂性很难判断其产生的效应是原位病变还是继发性病变，从而导致错误的结论；因此，目前有关的研究实践迫切需要构建能够达到组织特异性基因敲除的动物模型。

基于现有技术的现状，本申请针对目前VDR基因生理功能广泛，局部的作用机理未明，缺乏相关的动物研究模型，拟提供一种VDR基因条件性敲除的floxed小鼠模型构建方法，构建的VDR-floxed小鼠，将有益于该领域的研究实践。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种VDR基因条件性敲除的floxed小鼠模型构建方法，构建的VDR-floxed小鼠模型，将有益于该领域的研究实践。