[发明专利]人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种人Agrin抗原的制备方法，其特征在于，所述人Agrin抗原由以下任意一种片段或者七种片段组成：

片段1：Agrin-40，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段2：Agrin-411，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

片段3：Agrin-701，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

片段4：Agrin-1103，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

片段5：Agrin-1281，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

片段6：Agrin-1635，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

片段7：Agrin-1864，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述制备方法包括如下步骤：

步骤1、将Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864共7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建7个重组表达质粒；

步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建7个重组表达工程菌；

步骤3、Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的抗原片段的诱导表达及纯化；

所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将7个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述7个片段的引物对分别为：

Agrin-40-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

Agrin-40-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

Agrin-411-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

Agrin-411-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

Agrin-701-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

Agrin-701-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

Agrin-1103-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

Agrin-1103-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

Agrin-1281-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

Agrin-1281-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

Agrin-1635-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

Agrin-1635-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

Agrin-1864-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

Agrin-1864-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA 1ul；Taq E 0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。