[发明专利]CADASIL病人特异性血管平滑肌细胞与血管内皮细胞的制备方法

权利要求书

1.一种制备CADASIL疾病细胞模型的方法，包括如下步骤：

a)将来源于携带NOTCH3基因杂合突变的CADASIL病人的离体成纤维细胞进行重编程得到诱导多能干细胞系；

b)将所述诱导多能干细胞系定向分化为血管壁细胞，得到CADASIL疾病细胞模型。

2.一种由源于CADASIL病人的离体成纤维细胞制备血管壁细胞的方法，包括如下步骤：

a)将来源于携带NOTCH3基因杂合突变的CADASIL病人的离体成纤维细胞进行重编程得到诱导多能干细胞系；

b)将所述诱导多能干细胞系定向分化为血管壁细胞，得到CADASIL疾病细胞模型。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述离体成纤维细胞为离体皮肤成纤维细胞；

或，所述血管壁细胞为血管壁中层细胞和/或血管壁内膜细胞；

和/或，所述血管壁中层细胞具体为血管平滑肌细胞；

和/或，所述血管壁内膜细胞具体为血管内皮细胞。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述重编程的方法包括如下步骤:

a-1)将pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL质粒导入所述成纤维细胞中，继续培养，得到转染诱导因子细胞；

a-2)将所述转染诱导因子细胞在胚胎干细胞培养基中诱导培养，得到诱导多能干细胞系。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤a-1)中，所述继续培养采用的培养基为成纤维细胞培养基，所述培养的时间为4-5天；

或，步骤a-2)中，所述诱导培养采用的培养基为诱导多能干细胞培养基；所述诱导培养时间大于等于2周。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述将诱导多能干细胞定向分化为血管平滑肌细胞包括如下步骤：

b-1)将所述诱导多能干细胞系在血管平滑肌细胞诱导培养基-1诱导培养；

b-2)将b-1)处理后细胞在血管平滑肌细胞诱导培养基-2继续诱导培养，得到血管平滑肌细胞；

和/或，所述血管平滑肌细胞诱导培养基-1具体包括Neurobasal、N2、B27、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇、BMP4和CHIR99021；

所述血管平滑肌细胞诱导培养基-2具体包括Neurobasal、N2、B27、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇、PDGF-BB和Activin A；

和/或，所述在血管平滑肌细胞诱导培养基-1诱导培养的时间为3天；

和/或，所述在血管平滑肌细胞诱导培养基-2继续诱导培养的时间为2天；

和/或，在b-2)中的继续诱导培养后还包括用血管平滑肌细胞标记物CD140b筛选阳性细胞的步骤。

7.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述将诱导多能干细胞定向分化为血管内皮细胞包括如下步骤：

b-A)将所述诱导多能干细胞系在血管内皮细胞诱导培养基-1诱导培养；

b-B)将b-A)处理后细胞在血管内皮细胞诱导培养基-2继续诱导培养，得到血管内皮细胞细胞；

和/或，所述血管内皮细胞胞诱导培养基-1包括BMP4、CHIR99021、IWP2和FGF2；

和/或，所述血管内皮细胞诱导培养基-2包括VEGF、IL6和FGF2；

和/或，所述在血管内皮细胞诱导培养基-1诱导培养的时间为3天；

和/或，所述在血管内皮细胞诱导培养基-2继续诱导培养的时间为3天；

和/或，在步骤b-B中继续诱导培养两天后还包括用血管内皮细胞标记物CD34、CD201和CD144筛选阳性细胞的步骤。

8.由权利要求1-7所述的方法制备的血管壁细胞或CADASIL疾病细胞模型。