[发明专利]一种提高乌菜外植体瞬时表达率的定向遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种操作简单、瞬时表达率高的乌菜外植体定向遗传转化方法。其特征包括以下步骤：(1)乌菜5天无菌苗，切取子叶‑子叶柄及下胚轴外植体。(2)乌菜外植体在预培养基上培养2天。(3)农杆菌(含有植物表达载体)在活化培养基上活化。(4)利用经液体共培养基湿润的无菌棉棒蘸取活化的农杆菌，定向涂抹于外植体切口处。(5)涂抹后的外植体，置于固体共培养基上，25℃暗培养2天完成共培养，即可检测瞬时表达率。本发明采用的定向遗传转化方法，具有无需液体培养农杆菌、操作简单、外植体的瞬时表达率高等优点，为高效获得乌菜转基因植株奠定基础。

技术领域

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种操作简单、瞬时表达率高的乌菜外植体定向遗传转化方法。

背景技术

乌菜，原产我国，为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是江淮地区种植面积最大的蔬菜之一。长期以来，乌菜品种改良主要通过品种杂交、远缘杂交等，存在育种年限长、成本高、亲本自交多代易退化、雄性不育转育困难等诸多弊端，并且至今尚无成熟的再生系统。目前，在白菜类作物中，多采用农杆菌介导法进行遗传转化，将外植体与一定浓度的液体农杆菌共培养15～20min后，去除农杆菌，再在共培养基上进行共培养。该方法，将外植体置于液体农杆菌中，会使外植体短时间内缺氧，造成外植体损伤，而且农杆菌会侵染外植体上不需侵染的部位，也同样造成外植体损伤；此外，该方法在乌菜上应用是，乌菜外植体的瞬时表达率非常低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种无需对农杆菌进行液体培养、操作简单、瞬时表达率高的乌菜定向遗传转化方法，为高效获得乌菜转基因植株奠定了基础。

本发明的技术方案是：一种提高乌菜外植体瞬时表达率的定向遗传转化方法，其特征包括以下步骤：

(1)取5天苗龄的无菌苗，切取子叶-子叶柄或下胚轴外植体；

(2)将外植体置于预培养基上，25℃光照培养2天；

(3)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；

(4)用液体共培养基，将无菌棉棒湿润；

(5)用湿润的棉棒蘸取活化的农杆菌，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；

(6)在固体共培养基表层放置一张无菌滤纸；

(7)将涂抹后的外植体，平铺在固体共培养基上，25℃暗培养2天；

(8)暗培养结束后，GUS化学染色外植体。

所述步骤(2)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、乙酰丁香酮(AS)和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、AS 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；

所述步骤(3)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO₄·7H₂O、6-BA、As和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、6-BA 1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；

所述步骤(4)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；

所述步骤(6)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。

本发明的有益效果是：