[发明专利]一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法

说明书

本发明公开了一种成本低、周期短、重复性好、操作简单、转化效率高的同步获得乌菜雄性不育系与保持系转基因植株的方法。其特征包括以下步骤：(1)盛花期去除不育系与保持系植株已开放的花，用纸袋套住花序并密封。(2)剥除保持系3～5mm大小花蕾的萼片与花瓣。(3)侵染液悬浮农杆菌菌体至OD₆₀₀＝0.2。(4)侵染液滴至保持系花药上并暗处理2天。(5)采用授粉工具对保持系与不育系花朵柱头进行人工授粉。(6)重复上述操作3次。(7)分别采收不育系和保持系种子。(8)采收的种子进行Kan抗性及GUS染色鉴定，即可获得转基因植株。本方法直接在大田操作，不需要通过组织培养，即可获得转基因乌菜雄性不育系植株。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别提供了一种成本低、周期短、重复性好、操作简单、效率高的同步获得乌菜雄性不育系与保持系转基因植株的方法。

背景技术

乌菜，原产我国，为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是江淮地区种植面积最大的蔬菜之一。长期以来，乌菜品种改良主要通过品种杂交、远缘杂交等，存在育种年限长、成本高、亲本自交多代易退化、雄性不育转育困难等诸多弊端，并且至今尚无成熟的再生系统。目前，农杆菌介导法、基因枪法、超声波辅助转化法等等均需要再生体系；注射法需要较大的花器；花粉管通道法需要对柱头进行切口，且转化效率很低，这些遗传转化技术限制了乌菜基因工程的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，以解决现有技术中乌菜改良品种成本高、操作复杂等问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、在乌菜盛花期，去除雄性不育系与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系主花序3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药；

步骤2、将含有植物表达载体的农杆菌培养至OD₆₀₀＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD₆₀₀＝0.2；

步骤3、利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；

步骤4、2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉；

步骤5、授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；

步骤6、在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；

步骤7、一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；

步骤8、将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株。

进一步，所述步骤2中侵染液各成分为每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES0.5g、乙酰丁香酮0.2mg和L-半胱氨酸0.12g，pH为5.8。

进一步，所述步骤8中筛选培养基由MS、蔗糖、Kan和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、Kan 500mg、琼脂15mg，pH为5.8。

进一步，将步骤4替换为2天后，花蕾开放，利用干净毛笔，轻轻蘸取保持系花药上的花粉，对雄性不育系及保持系花的柱头进行辅助授粉。

本发明的有益效果是：