[发明专利]用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的AS-PCR引物及其应用

说明书

本发明提供了一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的AS‑PCR引物，所述AS‑PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物如SEQ ID NO：2所示；本发明还提供了用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的试剂盒，所述试剂盒包括所述的AS‑PCR引物；本发明还提供了采用所述AS‑PCR引物用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的的方法；该引物采用3端错配原则对Asia‑I型和疫苗株进行鉴别：对Asia‑I检测结果均为阳性，而疫苗株则均为阴性，能够准确区分CDV中Asia‑I和疫苗株，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

技术领域

本发明涉及种群鉴定技术领域，尤其涉及用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的AS-PCR引物及其应用。

背景技术

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)属于副粘病毒科麻疹病毒属成员，是单股负链不分节RNA病毒，其基因组为15690bp，共编码6个结构蛋白，分别是缠绕病毒RNA表面形成核衣壳蛋白(N蛋白)、参与形成核酸复合体的磷蛋白(P蛋白)和大蛋白(L蛋白)、促发宿主细胞膜－病毒囊膜融合的血凝素蛋白(H蛋白)和融合蛋白(F蛋白)与病毒囊膜相关的基质膜蛋白。犬瘟热病毒基因组各蛋白基因顺序：3’—UTR—N—P(C，V)—M—F—H—L—UTR—5’犬瘟热病毒的2个囊膜糖蛋白H蛋白和F蛋白，前者负责病毒与宿主细胞受体蛋白粘附结合，从而导致具有膜融合活性的F蛋白构象发生变化，从而促使病毒囊膜与感染细胞膜融合，启动病毒感染细胞的第一步，因此犬瘟热髌骨感染过程中H基因是致病性的决定因素之一。同时H基因是犬瘟热病毒基因稳定性最低的基因，根据不同毒株CDV的H基因序列系统进化树分析，CDV具有地理亲缘性，按照地理位置不同可分为多个基因性包括：亚洲Ⅰ型(Asia-Ⅰ)、亚洲Ⅱ型(Asia-Ⅱ)、美洲Ⅰ型(America-Ⅰ)又称疫苗型、美洲Ⅱ型(America-Ⅱ)、欧洲型(European)以及非洲型(Africa)等。

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由CDV感染犬或其它肉食目动物所引起的急性、高度接触性传染病。临床以双相热、红疹、结膜炎及中枢神经系统损害为主要特征。自1809年首次报道以来，该病已呈世界性分布，给养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成巨大危害。CD感染可导致犬、貂、狐等的病死率达30％-80％，雪貂高达100％。而对于CD的防治，除采用疫苗进行定期的免疫接种外，尚无特异性治疗方法。而目前用于CD防制的主要为弱毒疫苗，弱毒疫苗大规模应用使得区分动物自然感染与疫苗免疫(DiffreentiatingInfected from vaccinated Animals，DIVA)变得非常困难。因此建立一种可以鉴别诊断CDV强、弱野毒感染的敏感而特异的检测方法已势在必行。

目前CDV检测方法有很多，包括病毒分离培养、动物接种试验、血清学诊断方法、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR等。其中病毒分离和动物试验不同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不足；常规的血清学试验又很难鉴别CDV野毒感染和疫苗接种，而Real time RT-PCR方法对实验仪器的要求很高，并不适合临床检测。目前临床检测CDV的方法主要是胶体金检测和RT-PCR，但是都不能区分出野毒株和疫苗株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的AS-PCR引物及其应用，该引物采用3端错配原则对Asia-I型和疫苗株进行鉴别：对Asia-I检测结果均为阳性，而疫苗株则均为阴性，能够准确区分CDV中Asia-I和疫苗株，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。在犬瘟热早期检测和快速诊断中具有重要意义。

本发明的目的之一在于提供一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的AS-PCR引物，所述AS-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述反向引物如SEQ ID NO：2所示。

本发明的目的之二在于提供一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的试剂盒，所述试剂盒包括所述的AS-PCR引物。