[发明专利]一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用

说明书

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将SEQ ID NO.2所示的纤维二糖差向异构酶突变体基因连接到pBSMuL3载体上，构建重组质粒pBSMuL3‑ce^(‑)，并转化枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2016536，得到重组枯草芽孢杆菌。以此重组菌为菌种，发酵生产纤维二糖差向异构酶，获得的重组酶酶活达8U/mL。将重组酶用于制备乳果糖，在80℃、pH 7.5、加酶量20U/mL、底物浓度400g/L的反应条件下，CE催化乳糖生成乳果糖的产量为200g/L，转化率可达51％。

技术领域

本发明涉及一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

乳果糖(Lactulose)是一种不易消化的二糖，其成品为黄色澄明液体，甜度相当于乳糖，但小于蔗糖，约48％-60％蔗糖，口感凉醇，粘度低，热量低，安全性高，稳定性好。此外，乳果糖可增值双歧杆菌的活性，是一种良好的双歧杆菌促进因子，因而，乳果糖在医药行业、食品和动物饲料领域得到了广泛的应用。

商业化的乳果糖主要是通过化学法制备的，但是化学法需要添加大量的催化剂，反应所需要的条件一般也比较激烈，得到的产物副产品较多，这些混合物给后续的产品分离带来了很大的不便。相比之下，生物酶法制备乳果糖具有很多优势，其反应条件温和，卫生安全，符合低碳经济和绿色环保的要求。

目前主要用于催化乳糖生成乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase，EC3.2.1)和纤维二糖差向异构酶(CEs，EC5.1.3.11)。其中，纤维二糖差向异构酶(CEs)能够直接催化单一乳糖生产乳果糖，是目前最高效的乳果糖制备用酶，因而受到了广泛的研究。然而，野生型的纤维二糖差向异构酶活力较低，一般通过构建基因工程菌的方式提高其表达水平。

目前，在大肠杆菌、毕赤酵母中异源表达纤维二糖差向异构酶均出现过相关报道，但效果并不理想。2016年，韩亮等将Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的的纤维二糖差向异构酶CsCEm基因进行密码子优化，然后进行全基因合成，再将其引入到载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-CsCEm，并转化入毕赤酵母GS115，得到酵母工程菌株，该菌株经甲醇诱导144h后，摇瓶发酵液上清酶活达到0.42U/mL(见韩亮，杨瑞金，赵伟等，纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[J].工业微生物，2016，46(1):16-21)；以大肠杆菌为宿主时，2015年，汪明明等以E.coli BL21(DE3)为宿主，异源表达Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的纤维二糖差向异构酶，在重组菌菌体培养至OD600＝0.6时加入终浓度为10g/L的乳糖，25℃下诱导20h，最终发酵液中Cs CE酶活达0.801U/mL(见汪明明，杨瑞金，华霄等，乳糖诱导纤维二糖差向异构酶的表达及热处理纯化[J].食品与发酵工业，2015，41(3):1-7)。且大肠杆菌、毕赤酵母都不是食品安全级菌株，由这些菌株获得的重组酶若要进一步应用于食品领域，其安全性存疑。

因此，提供一种条件温和、易于纯化、卫生安全、环保、活力较高的纤维二糖差向异构酶生产方法，对于工业制备乳果糖具有重要的应用价值。

发明内容