[发明专利]基于FRET的端粒酶活性检测方法

说明书

本发明公开了一种基于FRET的端粒酶活性检测方法，包括以下步骤：首先设计荧光修饰的Flare DNA；再利用四个单链DNA:S1、S2、S3、S4，构建出DNA四面体结构；然后将DNA四面体与Flare DNA进行杂交，获得荧光DNA纳米探针；再将荧光DNA纳米探针与端粒酶混合反应，获取混合物的荧光光谱。本发明设计的基于FRET的荧光探针，可提供精确的检测结果，避免了假阳性信号的产生并使生物成像中系统波动的影响最小化。另一方面，三维(3D)DNA纳米结构具有优异的生物相容性和纳米级可控性，可以通过快速内吞途径进入细胞内，并保持细胞基本的完整性和稳定性，经过合理组装后可应用于生物传感和生物成像。

技术领域

本发明涉及端粒酶检测技术领域，特别涉及一种基于FRET的端粒酶活性检测方法。

背景技术

端粒酶被认为是早期癌症诊断的关键生物标志物，开发敏感而实用的端粒酶活性检测方法对于临床诊断，生物学研究和抗癌药物的开发具有重要意义。基于聚合酶链式反应的端粒重复序列扩增方案(TRAP)是检测端粒酶最常用的方法，另外还开发了许多其他应用，比如荧光、比色、电化学和电化学发光等技术来探测端粒酶活性。虽然这些方法具有较好的灵敏度，但是大多数需要细胞裂解样品，导致细胞来源的人工损失，还面临复杂的操作和误报读数。此外，只有少数基于DNA四面体的探针被设计用于细胞内端粒酶分析，这些探针主要基于单一信号源检测。因此，很多无法避免源自核酸酶消化、蛋白质结合或热力学波动的高假阳性信号。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于FRET的端粒酶活性检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于FRET的端粒酶活性检测方法，包括以下步骤：首先设计两端分别修饰Cy3和Cy5荧光团的单链Flare DNA；再利用四个单链DNA:S1、S2、S3、S4，构建出DNA四面体结构，其中，S4链在其3'末端含有引物区段，用于端粒酶催化的延伸，S1被设计成具有两个Flare互补区域，其在DNA四面体的形成期间保持未杂交；然后将DNA四面体与Flare DNA进行杂交，获得荧光DNA纳米探针；再将荧光DNA纳米探针与端粒酶混合反应，获取混合物的荧光光谱，并对荧光光谱进行分析处理，实现对端粒酶活性的测定。

优选的是，该方法还包括将经端粒酶抑制剂AZT处理后的延伸溶液与荧光DNA纳米探针混合反应，获取混合物的荧光光谱，并对荧光光谱进行分析处理，以作为对照实验。

优选的是，该基于FRET的端粒酶活性检测方法具体包括以下步骤：

1)设计荧光标记的Flare DNA探针，在其单链DNA的两端分别修饰Cy3和Cy5荧光团；

2)利用四个单链DNA:S1、S2、S3、S4，通过自下而上的退火反应，将等摩尔量的四种探针在Tris-HCl缓冲液中混合，并完全杂交，构建出DNA四面体结构；

其中，S4链在其3'末端含有引物区段，用于端粒酶催化的延伸反应，S1被设计成具有两个Flare互补区域，其在DNA四面体的形成期间保持未杂交；

3)通过在等摩尔量的互补序列之间进行杂交，将形成的DNA四面体与Flare DNA杂交获得荧光DNA纳米探针；

4)进行端粒酶活性的体外测量：提取端粒酶，再将端粒酶提取物与荧光DNA纳米探针混合反应，获取混合液的荧光光谱，并对荧光光谱进行分析，实现对端粒酶活性的测定。

优选的是，所述步骤4)中还包括：设置对照实验，端粒酶抑制剂AZT处理后的延伸溶液与荧光DNA纳米探针混合反应，获取其荧光光谱，并对荧光光谱进行分析。