[发明专利]基于FRET的端粒酶活性检测方法

权利要求书

1.一种基于FRET的端粒酶活性检测方法，该检测方法不用于疾病的诊断，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：首先设计两端分别修饰Cy3和Cy5荧光团的单链Flare DNA；再利用四个单链DNA:S1、S2、S3、S4，构建出DNA四面体结构，其中，S4链在其3'末端含有引物区段，用于端粒酶催化的延伸，S1被设计成具有两个Flare互补区域，其在DNA四面体的形成期间保持未杂交；然后将DNA四面体与Flare DNA进行杂交，获得荧光DNA纳米探针；再将荧光DNA纳米探针与端粒酶混合反应，获取混合物的荧光光谱，并对荧光光谱进行分析处理，实现对端粒酶活性的测定；

该方法具体包括以下步骤：

1)设计荧光标记的Flare DNA探针，在其单链DNA的两端分别修饰Cy3和Cy5荧光团；

2)利用四个单链DNA:S1、S2、S3、S4，通过自下而上的退火反应，将等摩尔量的四种探针在Tris-HCl缓冲液中混合，并完全杂交，构建出DNA四面体结构；

其中，S4链在其3'末端含有引物区段，用于端粒酶催化的延伸，S1被设计成具有两个Flare互补区域，其在DNA四面体的形成期间保持未杂交；

3)通过在等摩尔量的互补序列之间进行杂交，将形成的DNA四面体与Flare DNA杂交获得荧光DNA纳米探针；

4)进行端粒酶活性的体外测量：提取端粒酶，再将端粒酶提取物与荧光DNA纳米探针混合反应，获取混合液的荧光光谱，并对荧光光谱进行分析，实现对端粒酶活性的测定；

所述步骤4)中还包括：设置对照实验，荧光DNA纳米探针与经端粒酶抑制剂AZT处理后的延伸溶液混合反应，获取其荧光光谱，并对荧光光谱进行分析。

2.根据权利要求1所述的基于FRET的端粒酶活性检测方法，其特征在于，在所述步骤4)之后还包括对细胞内端粒酶活性进行原位成像：先将细胞接种于培养皿中培养，随后将荧光DNA纳米探针加入培养皿中，温育后，洗涤细胞获取共聚焦荧光图像；并设置对比实验，在对比实验中，培养皿中先加入AZT以使端粒酶失活，再加入荧光DNA纳米探针获取共聚焦荧光图像；分析比较两共聚焦荧光图像。

3.根据权利要求2所述的基于FRET的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，将等摩尔量的四种探针在Tris-HCl缓冲液中混合后，将混合物加热至95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至室温以完全杂交。

4.根据权利要求3所述的基于FRET的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，获得荧光DNA纳米探针后将其稀释，以使最终浓度为2μM，使用前在4℃下存储。

5.根据权利要求4所述的基于FRET的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤4)中提取端粒酶的具体步骤为：将所有细胞在补充有10％FBS的DMEM中于37℃，5％CO₂环境中培养；在指数生长期期间，收集细胞并用磷酸盐缓冲液洗涤两次；最后，将10⁶个细胞重悬于200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液中；将混合物在冰上孵育半小时并吹打数次以彻底裂解细胞，然后将细胞溶液在4℃、12,000rpm下离心30分钟，将不溶物质遗弃；收集上清液，得到端粒酶提取物，立即用于端粒酶测定或在-80℃下冷冻保存。

6.根据权利要求5所述的基于FRET的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤4)中检测端粒酶活性的具体步骤包括：将得到的端粒酶提取物在裂解缓冲液中稀释成含有不同的细胞数的溶液，将600μL由所述步骤3)得到的DNA纳米探针溶液与20μL端粒酶延伸溶液、10μL端粒酶提取物在37℃下温育保持1小时；在对照实验中，为了抑制端粒酶活性，将50mMAZT与上述溶液混合，并且延伸反应持续2小时；通过Hitachi F-4600荧光分光光度计在525nm激发下获得反应后混合液的两种荧光光谱。