[发明专利]肌酐脱亚氨酶及其用途

说明书

本发明广泛地涉及肌酐测定领域。特别地，本发明提供了新颖的肌酐脱亚氨酶，其特征在于新颖的核酸和氨基酸序列以及优异的酶促活性。本发明还提供了这种肌酐脱亚氨酶的用途，包括确定样品中肌酐含量的方法。这些尤其可以用于检测肾脏疾病。

技术领域

本发明广泛地涉及肌酐测定领域。特别地，本发明提供了新颖的肌酐脱亚氨酶，其特征在于新颖的核酸和氨基酸序列以及优异的酶促活性。本发明还提供了这种肌酐脱亚氨酶的用途，包括确定样品中肌酐含量的方法。这些尤其可以用于检测肾脏疾病。

背景技术

肌酐脱亚氨酶也称为肌酐酰胺水解酶(EC 3.5.4.21)，催化肌酐水解为N-甲基乙内酰脲，从而释放氨。它参与细菌代谢中肌酐的降解，并且对于尿液和血清中肌酐的诊断测定具有重要意义。肌酐脱亚氨酶是一种金属蛋白，而Zn²⁺和Fe²⁺对其活化有效。相关酶，即胞嘧啶脱氨酶的3D结构表明，Zn²⁺和Fe²⁺离子作为此类酶中的催化金属离子存在于活性位点。基于该结构，还可能生成来自肌酐泰氏菌(Tissierella creatinini)的肌酐脱亚氨酶的3D结构模型，其蛋白质序列在EP1325958A1中描述为SEQ ID NO：1。在该结构模型中，Zn²⁺原子位于活性位点(Nishiya，Int J Anal Bio-Sci，1：55-59，2013)。

已知来自肌酐泰氏菌的肌酐脱亚氨酶对于肌酐诊断分析中的应用具有优越的性能。EP1325958A1描述了该酶的分子克隆和重组表达。然而，到目前为止，就发明人所知，科学或专利文献中没有关于EP1325958A1的重组酶的重组生产或使用的报道。

发明人试图根据EP1325958A1中描述的序列信息和表达设置建立肌酐脱亚氨酶的重组生产方法。然而，所有尝试均以失败告终，因为EP1325958A1的教导导致了无酶促活性的肌酐脱亚氨酶蛋白。然后发明人发现肌酐脱亚氨酶的核苷酸和氨基酸序列不同于EP1325958A1中教导的那些，产生了活性蛋白。特别地，发明人在表达和活性分析实验中发现未翻译的区域能够或促进活性肌酐泰氏菌肌酐脱亚氨酶的表达。足够高的表达水平对于酶应用的商业化至关重要。

此外，发明人发现使用Mn²⁺作为催化金属离子增加了肌酐脱亚氨酶的活性和稳定性。与可商购获得的肌酐脱亚氨酶相比，在Mn²⁺负载下，该酶表现出优异的性能。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种经分离的肌酐脱亚氨酶多肽，其包含根据SEQ IDNO：4的氨基酸序列或其至少80％序列同一性变体，其中经分离的肌酐脱亚氨酶多肽具有肌酐脱亚氨酶活性。

在第二方面，本发明涉及编码如第一方面所定义的肌酐脱亚氨酶多肽的经分离的核酸。

在第三方面，本发明涉及包含第二方面的核酸的载体。

在第四方面，本发明涉及一种细胞，其包含第一方面的多肽、第二方面的核酸或第三方面的载体。

在第五方面，本发明涉及制备第一方面中所定义的肌酐脱亚氨酶多肽的方法，其包括以下步骤：

(i)在第四方面所定义的细胞中表达第二方面所定义的核酸，和

(ii)分离肌酐脱亚氨酶多肽。

在第六方面，本发明涉及用第五方面所定义的方法制备的肌酐脱亚氨酶多肽。

在第七方面，本发明涉及在第一方面或第六方面中定义的肌酐脱亚氨酶多肽在确定样品中肌酐含量中的用途。

在第八方面，本发明涉及一种适合于确定样品中肌酐含量的试剂盒，其包含第一方面或第六方面中所定义的肌酐脱亚氨酶多肽。