[发明专利]代谢工程

说明书

本发明总体上涉及通过在宿主中表达异源核苷酸序列以在宿主中生物合成皂皮酸的材料和方法，所述异源核苷酸序列中的每一种编码一种多肽，所述多肽组合起来具有所述QA生物合成活性。示例性多肽包括(i)β‑香树脂醇合酶；(ii)能够在C‑28位置处将β‑香树脂醇或其氧化衍生物氧化为羧酸的酶；(iii)能够在C‑16α位置处将β‑香树脂醇或其氧化衍生物氧化为醇的酶；和(iv)能够在C‑23位置处将β‑香树脂醇或其氧化衍生物氧化为醛的酶。优选的核苷酸序列从皂皮树(Q.saponaria)获得或衍生自皂皮树。

技术领域

本发明总体上涉及用于在宿主细胞中工程化或修饰皂皮酸产生或水解的基因和多肽。本发明进一步涉及系统、方法和采用所述系统、方法的产物。

背景技术

植物产生多种环状三萜烯，如甾醇和三萜类(triterpenoid)，所述环状三萜烯是甲羟戊酸(MVA)途径的主要产物。

QS-21是通过智利树皂皮树(Quillaja saponaria)(豆目)合成的复杂三萜类皂苷。

核心QS-21三萜烯骨架是皂皮酸(“QA”)；此骨架用存在于C-3位置处的支链三糖和存在于C-28位置处的直链四糖修饰。所述C-28直链四糖还以复杂的阿拉伯糖基化酰基链为特征(图1)。

QS-21用作免疫刺激佐剂。然而，QS-21的生物学来源是有限的，并且由于其结构和QA的复杂性，化学合成是具有挑战的。

因此，可以看出，用于合成QA的新颖系统，尤其用于制备QS-21，将对本领域做出贡献。

发明内容

QS-21(皂皮酸)的核心糖苷配基(aglycone)是简单三萜烯β-香树脂醇的衍生物，而所述β-香树脂醇是通过氧化鲨烯环化酶(OSC)使通用线性前体2,3-氧化鲨烯(OS)环化而合成的(图2)。

所述β-香树脂醇骨架进一步分别在C-16α、C-23和C-28位置处用醇、醛和羧酸氧化以形成皂皮酸。为此，在图2中给出了一个建议的线性生物合成途径，但应理解，这些氧化反应可以经由不同的中间体以不同的顺序发生(参见图11)。

因此，来自OS的QA生物合成包括至少四个不同的酶促步骤。所涉及的酶包括：

·氧化鲨烯环化酶；

·能够在C-28位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物氧化为羧酸的酶；

·能够在C-16α位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物(如齐墩果酸)氧化为醇的酶；

·能够在C-23位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物(如刺囊酸)氧化为醛的酶。

图11中示出了由这些酶的连续氧化作用所产生的β-香树脂醇的氧化衍生物，并且总结于下表中：

举例来说，使用图2的说明性方案，这些酶可以分别是：

·β-香树脂醇合酶；

·能够将β-香树脂醇氧化为齐墩果酸的酶；

·能够将齐墩果酸氧化为刺囊酸的酶；

·能够将刺囊酸氧化为QA的酶。

诸位发明人已经成功地将整个QA生物合成途径工程化到异源生物中，所述异源生物原本不是QA产生者。具体地，诸位发明人通过将根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株共渗入本氏烟草(N.benthamiana)中来证明了本发明。在此首次描述了通过生物合成基因的共表达实现了皂皮酸的异源生产，并且代表了对本领域的主要贡献。