[发明专利]MHC多聚体的生产方法

说明书

本发明涉及通过使用温度介导的肽交换来产生负载有所需肽的MHC多聚体的快速、灵活和有效的方法。该方法可以同时并行用于不同的所需肽。在该方法中，使用条件性肽，该条件性肽在低温下形成稳定的肽‑MHC复合物，但在暴露于限定的提高的温度时会解离。所得的条件性MHC I复合物和多聚体能够负载选择的肽。

发明背景

免疫监视由结合细胞内肽用于呈递给CD8⁺T淋巴细胞的主要组织相容性I类(MHCI)复合物介导。这种区分自身和外来物的能力是适应性免疫的基础，且如果没有这样做可能导致自身免疫性疾病的发生。在生命中，人类不断受到病原体(例如病毒)的攻击。它们中的一些会建立终身感染，其中病毒以潜伏状态持续存在而不会引起症状，但偶尔会重新激活。引起复发性感染的这样的病毒中的一类是疱疹病毒¹。

通常，重新激活不会导致疾病，因为一旦识别出病毒抗原，感染就会被T细胞迅速清除。但是，在移植的情况下，当患者是免疫妥协的时，疱疹病毒(如巨细胞病毒(CMV)或埃巴病毒(EBV))的重新激活会导致严重的健康威胁^2，3。因此，监测移植接受者中的T细胞数量以预测患者是否可能清除感染或是否需要干预是非常重要的。

可以动用适应性免疫系统以使我们受益。在过去的十年中，旨在抑制或增强细胞免疫反应的免疫疗法已经取得了巨大的进步。包括针对CTLA-4和PD-1/PD-L1的抗体在内的几种免疫检查点抑制剂已被批准用于临床，并且在包括黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌在内的各种癌症的治疗中显示出了显著的响应^4-8。

作为检查点阻断的结果，针对新抗原引起的T细胞应答显著增加，导致改善的癌细胞的杀伤^9，10。针对免疫检查点的治疗方法和癌症突变组(mutanome)中的信息相结合，在个性化癌症治疗中具有广阔的前景。因此，识别针对新抗原和有助于免疫治疗成功的其他癌症特异性表位的T细胞应答是至关重要的。

自1996年由Altman等人首次使用以来，MHC多聚体-带有抗原肽的MHC单体的低聚体-标记有荧光染料对于通过流式细胞术分析和监测抗原特异性T细胞来说，已经是最广泛使用的试剂¹¹。

但是，多聚体的产生涉及许多耗时的步骤，包括在细菌中表达例如MHC I重链和β2-微球蛋白、与所需肽重折叠、纯化、生物素化和多聚化¹¹。最初，由于空的MHC I分子是不稳定的，因此必须对每个个体肽-MHC I复合物进行所有这些步骤。

这促使人们寻求寻找生成包括MHC I分子在内的肽接受性MHC分子的方法，以使得随意地由单个输入的MHC I-肽复合物并行产生多个MHC多聚体。例如，我们和其他人已经开发了几种旨在在MHC I上进行肽交换的技术，例如使用高碘酸盐或连二亚硫酸盐作为化学触发剂来原位切割条件性配体，或使用二肽作为催化剂，之后肽残余物能够解离并被选择的肽替代^13-16。

或者，将MHC单体与在UV暴露下裂解的可光裂解的肽重折叠，此后个体肽残余物解离，空的MHC I分子能够负载选择的肽随后进行多聚化^17-19。这种方法已经促进了无数表位的发现和对相应T细胞的监测^18，20-22。但是，UV交换技术需要使用可光裂解的肽和紫外线光源。UV暴露和配体交换与荧光标记的多聚体不兼容，且生物素化负载肽的MHC I分子需要在交换后在链霉亲和素上进行多聚化。其他缺点包括在UV介导的裂解下生成反应性亚硝基物质，以及MHC I和/或相关肽的光损伤，而生成的热量则导致样品蒸发。