[发明专利]被检样品中的细菌数的定量方法

说明书

本发明的课题在于提供能够使用PCR法迅速且精度良好地定量被检样品中的细菌菌数的方法。作为解决上述课题的方法，利用以下的工序进行被检样品中的细菌的鉴定及定量。(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用用于扩增细菌的16S rRNA基因的通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；(2)第二PCR工序，使用用于扩增利用前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及(3)菌数定量工序，使用校准用的数据，从由前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的细菌数。另外，也可以在上述的工序(1)～(3)的基础上追加以下的工序(4)及(5)。(4)菌种鉴定工序，对前述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。(5)细菌数校正工序，以由前述菌数定量工序求出的细菌数作为暂定细菌数，基于前述对照细菌及由前述菌种鉴定工序鉴定出的菌种的16S rRNA操纵子拷贝数来校正暂定细菌数，从而确定前述被检样品中的细菌数。

技术领域

本发明涉及使用PCR法迅速且精度良好地进行被检样品、特别是血液被检样品中的细菌数的定量、或者细菌数的定量及细菌菌种的鉴定的方法。

背景技术

败血症的重症度判定中所使用的传统检查项目为血液培养、内毒素、降钙素原、白细胞数、CRP(C-reactive protein，C-反应蛋白)、血压、体温、呼吸数、脉搏数等，最近新增加了Presepsin(可溶性CD14亚型，sCD14-ST)。由于血液培养结果需要时间，因此难以反馈到早期治疗中。由于白细胞数、CRP是宿主侧的感染防御反应，因此检查值与重症度产生时间差，常常成为与实际的重症度背离的值。降钙素原在特异性、定量性方面存在困难，从而难以应用。Presepsin无法用于肾功能障碍的患者。这样一来，作为实时地反映感染症的重症度、治疗效果的指标，还不存在值得信赖的检查项目。如果可能，以患者被检样品中的菌数作为生物标记而用作感染症重症度的判定或监测治疗效果的指标是最直接的，也是合理的。

目前，被检样品中的菌数的标准定量分析通过培养所采集的患者被检样品来进行，但只是非常粗略的定量(仅分类为“1+”、“2+”、“3+”)。培养技术虽然被长年利用，但是检查耗费时间(通常为2～3天)，而且依赖于每个菌种不同的增殖能力，因此使用菌落形成单位(Colony-forming unit，CFU)的定量结果的可靠性低。因此，为了进行细菌数的正确测定，优选不依赖于培养的测定法。近年来，认为在除培养以外的方法中通用性最高的技术是定量PCR(实时PCR)法。

尝试利用实时PCR法对患者被检样品中的致病菌进行定量的情况下，在检查开始的时刻不鉴定致病菌，另外，混合感染也可能经常发生，因此需要使用细菌通用引物(bacterial universal引物)(其是检测几乎所有细菌的引物，以下有时简单记载为“通用引物”。)。但是，患者被检样品中的致病菌常常是少量的，因此有时在通常的实时PCR中不能达到足以正确定量的充分的灵敏度。另外，即使得到充分的灵敏度，在细菌通用PCR(bacterial universal PCR)(其为检测几乎所有细菌的PCR)中也会存在污染容易被检测的问题，在致病菌的判定中产生困难。其结果为：患者被检样品中的致病菌的定量检查尽管对于感染症治疗非常有用，但是因技术上未解决的问题而还未达到实用化。

关于利用PCR法的感染症病原菌的鉴定方法，在专利文献1中公开了下述感染症病原菌的迅速鉴定方法：使用来源于被检样品的核酸，使用多个特定引物组进行实时PCR，并使用所得的多个扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对被检样品中的菌进行鉴定。

在专利文献2中公开了可实现检测灵敏度提高的真核生物生产的耐热性DNA聚合酶和基于使用了该耐热性DNA聚合酶的PCR法的细菌菌种的鉴定方法。

在专利文献3中公开了如下用途的多个引物对：使用来源于被检样品的核酸进行实时PCR，使用所得的扩增产物的熔解温度(Tm值)对被检样品中的菌进行鉴定。

现有技术文献

专利文献