[发明专利]被检样品中的细菌数的定量方法

权利要求书

1.对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16S rRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；

(2)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及

(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与所述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。

2.如权利要求1所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(A)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16S rRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；

(B)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；

(C)第三PCR工序，使用与菌种已知的对照细菌的已知细菌数对应的核酸试样，利用PCR法得到第三扩增产物；

(D)第四PCR工序，使用通过所述第三PCR工序得到的第三扩增产物，利用巢式PCR法得到第四扩增产物；

(E)由所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序；以及

(F)菌数定量工序，使用所述校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。

3.如权利要求2所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其中，通过以下的工序进行所述工序(C)、(E)及(F)：

(C-1)第三PCR工序，分别使用与菌种已知的对照细菌的不同的多个已知细菌数对应的多个核酸试样，利用PCR法得到第三扩增产物；

(E-1)从所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准曲线的工序；以及

(F-1)菌数定量工序，使用所述校准曲线，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。

4.如权利要求1～3中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，以所述第一PCR工序中的基因扩增未到达平台期的循环数进行所述第一PCR工序。

5.如权利要求1～4中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有将包含所述第一扩增产物的反应液进行稀释而供于所述第二PCR工序的稀释工序。

6.如权利要求2～5中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，在同一PCR装置内同时进行所述第一PCR工序和所述第三PCR工序，并且在同一PCR装置内同时进行所述第二PCR工序和所述第四PCR工序。

7.如权利要求1～6中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，还具有下述工序：分别使用多个引物对进行第二PCR工序，基于经各引物对所扩增的多个扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合或Tm值间的差值的组合，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。

8.如权利要求7所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，使用所述第二PCR工序用的多个引物对中的至少1者进行所述第四PCR工序(其中，在使用多个引物对的情况下，分别使用多个引物对进行第四PCR工序)。

9.如权利要求1～8中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，所述对照细菌为大肠杆菌。

10.如权利要求1～9中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，在所述第一PCR工序中使用的通用引物对中，正向引物、反向引物中的一者或两者为等量地混合有1个碱基不同的2种引物而成的。