[发明专利]减少表达基于NKG2D的受体的免疫细胞的杀伤剂

说明书

本发明涉及免疫疗法领域，更具体地涉及用于过继细胞疗法的细胞的制造。本文提供了在此类细胞，特别是表达嵌合NKG2D受体的细胞的生产过程中预防和/或减少杀伤剂的方法。还提供了细胞和包含预防和/或减少杀伤剂的细胞的组合物。

技术领域

本发明涉及免疫疗法领域，更具体地涉及用于过继细胞疗法的细胞的制造。本文提供在这种细胞，特别是表达NKG2D受体细胞的细胞的生产过程中预防和/或减少杀伤剂的方法。还提供了细胞和包含预防和/或减少杀伤剂的细胞的组合物。

背景技术

我们对免疫系统的了解的改善导致了许多针对免疫的疗法的发展，这些疗法目前正在为晚期癌症患者提供客观的临床反应。这些方法之一是嵌合抗原受体(CAR)T细胞，其中患者的T细胞经过基因修饰以表达靶向 CAR的肿瘤，然后大量返还给患者(1)。这种过继性细胞疗法通过对血液系统恶性肿瘤患者的客观临床反应已经达到了一定水平的验证，并且正在进一步探索以治疗更广泛的癌症适应症(2-7)。CAR的概念也已超越T细胞，人们正在探索包括自然杀伤细胞在内的多种细胞类型(8)。

CAR是模块化蛋白质受体，其由连接至结构域的靶结合域组成，所述结构域通常包括细胞外间隔域和与细胞内信号传导域融合的跨膜区。配体结合后，从CAR引发的下游信号传导会激活T细胞的效应子功能，从而驱动直接的肿瘤细胞杀伤和免疫细胞因子的产生。

CAR T生产的一个常见问题是自我杀灭(或自相残杀)。当CAR靶标在T细胞群体上表达时，会发生这种现象。众所周知，T细胞杀伤剂是维持T细胞动态平衡的一种机制(13)。但是，在治疗方面，T细胞杀伤剂阻止了产生用于临床应用的所需CAR T细胞群体的能力。在针对T细胞谱系特异性选择靶标本身(例如CD7(14)或CD5(15))以实现T细胞白血病靶向的情况下，这尤其相关。但是，问题不仅仅限于CAR T细胞疗法。对靶蛋白(BIRC5)具有特异性的T细胞受体具有高亲和力TCR的T细胞由于靶抗原的表达而遭受杀伤(16，17)。同样，表达NK受体配体的NK细胞也显示出患有杀伤症(24)。

总之，借助于人工细胞表面嵌合抗原受体(CAR)构建体以预定的靶特异性赋予免疫细胞(例如T或NK细胞)提供了一种假定地靶向任何肿瘤细胞的方法。该方法的成功在很大程度上取决于靶抗原本身的概况，其中大多数已知的肿瘤抗原对肿瘤不是特异性的，但可能在非肿瘤细胞上表达。在某些情况下，靶抗原可以在免疫细胞上组成性或瞬时表达，这意味着CAR修饰的细胞可以进行自杀或杀伤。

在这里，重点是针对对天然杀伤组2D(NKG2D)蛋白靶向的应激配体进行特异性改造的CAR T细胞。全长NKG2D序列与CD3ζ的胞质结构域融合产生了一个CAR构建体，该结构在配体被NKG2D细胞外结构域结合后导致CD3ζ结构域激活T细胞(18)。NKG2D具有八个已知的配体，包括主要的组织相容性复合物I类相关的A和B基因(分别为MICA和 MICB)和UL16结合蛋白(ULBP)家族(ULBP1-6)(19)。已知这些NKG2D 配体的表达是在“应激”条件下诱导的，例如细胞损伤、感染、氧化或热应激或恶性转化，导致表达NKG2D配体的各种人类肿瘤突显了NKG2D作为在 CAR环境中要利用的受体的吸引力(19，20)。确实，带有小鼠NKG2D CAR 的小鼠T细胞在同基因模型系统中有效根除了一系列已建立的血液学和实体瘤，证明了该方法的概念性证明(18)。

带有人NKG2D CAR的人T细胞(也称为NKR-2)在体外可发挥效应细胞对多种肿瘤细胞的功能，并可在NSG小鼠模型中挑战已建立的人肿瘤 (21)。然而，事实证明，NKR-2细胞产量的增加以产生更高的细胞数量以用于临床应用，由于被激活的T细胞瞬时表达NKG2D配体而被确定为原因的T细胞杀伤剂被证明存在很大问题。