[发明专利]酶法合成寡核苷酸的方法和体系

说明书

本发明涉及在聚合酶存在下由单链固定化引物酶法合成寡核苷酸的方法、过程和系统。利用本发明的方法，在脱氧核糖核苷酸三磷酸或核糖核苷酸三磷酸存在下，可从单链固定化引物酶法合成单链寡核苷酸。双脱氧核糖核苷酸三磷酸酯、带有可逆终止子的脱氧核糖核苷酸三磷酸酯或带有可逆终止子的核糖核苷酸三磷酸酯可以酶法添加到引物或其延伸产物的末端。根据本发明的方法，单链引物可与模板结合，所形成的双链结构可使聚合酶在3’端延伸引物。

交叉引用

本申请要求2017年10月4日提交的第62/568,205号美国临时专利申请和2018年9月5日提交的第62/727,174号美国临时专利申请的权益，其全部内容通过引用结合到本文中。

背景

合成核酸(如寡核苷酸)在分子生物学、法医学和医学诊断等许多领域发挥着重要作用。寡核苷酸已成为现代生物技术和医学研究的重要工具。例如，寡核苷酸已被广泛应用于各种技术中，包括诊断探测法、聚合酶链式反应(PCR)、基因表达的反义抑制和核酸组装。寡核苷酸合成可能涉及基因组编辑，例如依赖CRISPR、DNAzymes(即通过体外选择获得的催化活性脱氧核苷酸(DNA)分子)、DNA折纸、用于数据存储的DNA和空间转录组学的应用。寡核苷酸的广泛应用也促进了核酸阵列的发展，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)阵列。

设计的核酸序列通过使用聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)方法连接相应的(先前合成的)寡核苷酸，一次组装一个。参见，如Smith等人，“通过全基因组组装生成合成基因组：合成寡核苷酸的X174噬菌体”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(26):15440-5(2003).Gibson是一种分子克隆方法，它允许在单个等温反应中连接多个DNA片段。参见，如Gibson等人，“酶法组装高达几百千碱基的DNA分子”。Nature Methods.6(5):343–345构建长寡核苷酸需要同时合成多个基因序列。然而，最先进的的寡核苷酸合成基本上是通过化学合成逐个完成的。参见Zhou等人，“寡脱氧核苷酸的微流控PicoArray合成和多个DNA序列的同时组装”，Nucleic Acids Res.,11:32(18):5409-17(2004)。

概述

通过聚合酶催化反应合成单链、固定化或液相寡核苷酸是可取的。本发明提供了通过使用一种酶来完成这种酶合成的方法，该酶需要不超过7个碱基对，即可从游离3’端延伸单链、固定寡核苷酸。在一些实施例中，酶法合成需要1、2、3、4、5、6或7个碱基配对，以从其游离3’端延伸单链、固定寡核苷酸。本发明还提供了通过使用改良聚合酶完成这种酶合成的方法，该聚合酶需要不超过7个碱基配对，即可将单链式溶液相寡核苷酸从其游离3’端延伸出来。在某些情况下，酶法合成需要1、2、3、4、5、6或7个碱基配对，才能从其游离3’端延伸出单链的液相寡核苷酸。

在一个方面，本发明提供了一种合成单链寡核苷酸的方法，包括：(a)提供包含游离3’端、聚合酶和核苷酸试剂的单链引物；(b)通过聚合酶将单链引物从游离3’端延伸至核苷酸试剂；聚合酶需要不超过7个碱基配对来延伸单链引物。

在一些实施例中，所述核苷酸试剂为带有3’端终止子的可逆终止核苷酸。在一些实施例中，单链引物还包括附着于基底的5’端。在一些实施例中，聚合酶是一种改良的聚合酶。在一些实施例中，该方法还包括:(c)从可逆终止核苷酸中去除3’端终止子。在一些实施例中，该方法还包括:(d)重复步骤(a)-(c)。在一些实施例中，(d)中的重复步骤将单链引物从游离3’端延伸，从而合成包含该单链引物的单链寡核苷酸产物。

在一些实施例中，该方法还包括在(b)之后和(c)之前：(b1)在聚合酶或末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在的情况下，用双脱氧核苷酸试剂处理单链引物。