[发明专利]酶法合成寡核苷酸的方法和体系

权利要求书

1.一种合成单链寡核苷酸的方法，包括:

(a)提供包含游离3’端、聚合酶和核苷酸试剂的单链引物；以及

(b)通过所述聚合酶用所述核苷酸试剂从所述游离3’端延伸所述单链引物；

其中，所述聚合酶需要不超过7个碱基配对来延伸所述单链引物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述核苷酸试剂是带有3’端终止子的可逆终止核苷酸。

3.根据权利要求1的方法，其中所述单链引物还包括连接至基底的5’-端。

4.根据权利要求1的方法，其中所述聚合酶是一种改性的/改良的/经修饰的聚合酶。

5.根据权利要求2的方法，还包括：

(c)从所述可逆终止核苷酸中移除所述3’端终止子。

6.根据权利要求5所述的方法，还包括：

(d)重复步骤(a)-(c)。

7.根据权利要求5方法，还包括在(b)之后和(c)之前:

(b1)在所述聚合酶或末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在下，用双脱氧核苷酸试剂处理所述单链引物。

8.根据权利要求1的方法，还包括在(a)之后和(b)之前：

(a1)将所述单链引物上的杂交位点与模板杂交，其中所述杂交位点位于所述3’端，且包含不超过7个碱基。

9.根据权利要求8的方法，其中所述模板是所述单链引物、附着于所述基底的相邻单链核酸或溶液中多个单链核酸模板中的一种。

10.根据权利要求9的方法，其中所述模板是所述相邻的单链核酸，并且其中所述相邻单链核酸与所述单链引物的序列一致性不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过35％、不超过40％、不超过45％、不超过50％、不超过55％、不超过60％、不超过65％、不超过70％、不超过75％、不超过80％、不超过85％、不超过90％或者不超过95％。

11.根据权利要求9的方法，其中所述模板是所述相邻单链核酸，并且其中所述相邻单链核酸与所述单链引物具有100％的序列一致性。

12.根据权利要求9的方法，其中所述模板是溶液中的所述多个单链核酸模板的成员，并且其中溶液中的所述多个单链核酸模板包括多个二聚体、多个三聚体、多个四聚体、多个五聚体、多个六聚体、多个七聚体、多个八聚体、多个九聚体、多个十聚体、多个十一聚体或多个十二聚体。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述多个单链核酸模板包含随机序列。

14.根据权利要求8的方法，其中所述杂交位点包含1、2、3、4、5、6或7个碱基。

15.根据权利要求8的方法，其中，(b)中所述延伸的效率在(a1)中所述模板的存在下得到提高。

16.根据权利要求8的方法，其中所述聚合酶需要1、2、3、4、5、6或7个碱基对来延伸所述单链引物。

17.根据权利要求1的方法，其中所述延伸在约20℃至约99℃之间进行。

18.根据权利要求17的方法，其中所述延伸在约50℃至约75℃之间进行。

19.根据权利要求17的方法，其中所述延伸在约55℃至约65℃之间进行。

20.根据权利要求17的方法，其中所述延伸在约60℃下进行。