[发明专利]制备cDNA文库的方法

说明书

本公开内容特别提供了制备cDNA文库的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括产生DNA:RNA杂交体，例如，通过逆转录RNA样品或通过使DNA寡核苷酸与RNA样品杂交，用RNA酶H处理DNA:RNA杂交体以产生包含RNA片段的经消化的样品；和(c)逆转录RNA片段。

交叉引用

本申请要求于2017年11月20日提交的美国专利申请序列号15/818,469的权益，该申请通过引用并入本文。

背景

总RNA样品通常含有其长度发生改变的RNA分子。例如，从哺乳动物细胞获得的总RNA样品可含有mRNA分子(其尺寸范围通常在几百个碱基到几kb)、lncRNA分子(其被分类为长度至少200个碱基)、18S和28S rRNA分子(其分别约为1.9kb和5kb)、tRNA分子(其通常长度低于100nt)和多种小RNA分子(例如，短干扰RNA、微RNA、小非编码RNA和小调节子RNA)，所述小RNA分子中许多的长度小于30个核苷酸。

用于对样品中的“较长”RNA(例如，mRNA和lncRNA)以及同一样品中的小RNA进行测序的常规方法通常涉及两个工作流程，一个工作流程用于较长的RNA而另一个工作流程用于小RNA。这样的方法可能很麻烦，并因此需要替代方法。

概述

本公开内容特别提供了制备cDNA文库的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括产生DNA:RNA杂交体，例如，通过逆转录RNA样品或通过使DNA寡核苷酸与RNA样品杂交，用RNA酶H处理DNA:RNA杂交体以产生包含RNA片段的经消化的样品；然后逆转录RNA片段。在某些情况下，RNA样品可以包含mRNA和小RNA(通常长度小于100个核苷酸并且中值长度是18至40个核苷酸的长度。在这些实施方案中，该方法可以包括例如逆转录mRNA而不是小RNA(例如，使用oligo(dT)引物或者一种或多种基因特异性引物)以产生包含小RNA和DNA:mRNA杂交体的产物。对这种产物的RNA酶处理产生可以包含小RNA以及mRNA片段的降解产物。在一些实施方案中，RNA片段的长度可与小RNA的长度大致相同，并且在某些情况下，可以被复制为cDNA进行相同的反应。因此在一些实施方案中，该方法可以包括逆转录小RNA和mRNA片段以产生cDNA文库，其中cDNA包含小RNA的cDNA拷贝和mRNA片段的cDNA拷贝。

附图的简要说明

当结合附图阅读下面的详细描述时，可以最好地理解本发明的一些方面。要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。实际上，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意地扩大或缩小。附图中包括以下图。

图1示意性地显示本方法的一个实施方案的一些原理。

图2示意性地显示本方法的另一个实施方案的一些原理。

图3示意性地显示如何制备cDNA文库的例子。

图4是显示在每个插入片段长度处的测序片段的数量的图。

定义

在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下定义以示例说明和定义在说明书中使用的术语的含义和范围。

数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则分别地核酸以5'至3'方向从左至右书写；并且，氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。